同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及体外分子检测的技术领域，公开了一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法，所述核酸组合物包括以下序列：CB2F：SEQ ID No：1；CB2R：SEQ ID No：2；CB2P：SEQ ID No：3；CB3F：SEQ ID No：4；CB3R：SEQ ID No：5；CB3P:SEQ ID No：6；CB4F：SEQ ID No：7；CB4R:SEQ ID No：8；CB4P:SEQ ID No：9；CB5F：SEQ ID No：10；CB5R:SEQ ID No：11；CB5P:SEQ ID No：12。本发明专利技术具有以下效果：能够快速准确的对柯萨奇病毒四种亚型进行筛查，特异性好。

【技术实现步骤摘要】
同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
本专利技术涉及体外分子检测的
，尤其是涉及一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。
技术介绍
柯萨奇病毒(coxsachievirus)是一种肠病毒，以血清学分析依据分为A和B两型，其中A型包含24种亚型，B型包含5种不同亚型。柯萨奇病毒A型感染表现为上呼吸道感染起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发热，全身不适；柯萨奇病毒B型感染引起特征性传染性胸肋痛，可合并脑膜脑炎、心肌炎、发热、肝炎、溶血性贫血和肺炎。目前，在体外核酸检测
中，实时荧光定量PCR技术作为国内外应用最为广泛的技术方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色Taq-Man荧光探针，结合相关荧光检测系统仪器，从而达到检测的目的。而在体外病毒RNA的核酸检测方法中，主要包括一步法RT-PCR法，荧光染料RT-PCR法和荧光探针RT-PCR法，其中一步法RT-PCR法由于需要进行开盖电泳，容易导致实验室污染，不宜大范围使用；而荧光染料RT-PCR法由于其荧光显色原理导致其易出现假阳性结果，因此也不适合临床检测。荧光探针RT-PCR法由于其特异性高、灵敏度高等优势，目前是应用最为广泛的技术。上述中的现有技术方案存在以下缺陷：现有的大多数检测试剂盒主要以单重单靶标检测技术为主，每一次操作仅能检测出一种病毒亚型，无法实现同时对多亚型病原体的分型检测，出于临床考虑，需要实现多靶标检测，以完成临床上对柯萨奇病毒的快速分型检测。专利技术内容本专利技术的目的是提供一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，从而能在一次反应中同时对柯萨奇病毒的四种B组亚型进行分型检测，以完成临床需求。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，包括以下引物和探针序列：CB2上游引物序列CACCAAAGAGAAGAAGTTTGCSEQIDNo：1；CB2下游引物序列CGTGAACAGTTCTAACTTCCTCSEQIDNo：2；CB2探针序列CAGCTTGCCTAACACTCACCTTCCATGSEQIDNo：3；CB3上游引物序列TGCTGAGTGGGTGATAACASEQIDNo：4；CB3下游引物序列AGCTCCAAATCAAACCTCATATACSEQIDNo：5；CB3探针序列TTCTTCGCAGTTGTACCGCCTGGCSEQIDNo：6；CB4上游引物序列TTCGTTGTGACATGGAACTGSEQIDNo：7；CB4下游引物序列ATTATTTGATGTGTCTGGACCGSEQIDNo：8；CB4探针序列TCAAGAGATGTCCACCGCCACCAACTSEQIDNo：9；CB5上游引物序列TGGGTGATCAATACCAGACASEQIDNo：10；CB5下游引物序列GGACTGTTCTTGTGTACTTGTTASEQIDNo：11；CB5探针序列CGCAACTACGCCGCAAGCTGGASEQIDNo：12。通过采用上述技术方案，本专利技术设计了不同的荧光标记Taq-Man探针，并同时设计筛选除了最佳的引物与探针组合，从而减小了不同的引物探针组合之间因相互抑制、竞争等原因而出现交叉扩增的可能性，提高了检测的灵敏度与特异性，进而本专利技术中的核酸组合物能够对样本中柯萨奇病毒的B2型、B3型、B4型和B5型进行快速筛查，能在一次反应中同时对柯萨奇病毒的四种B组亚型进行分型检测，达到临床需求。本专利技术的另一目的在于：提供一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，包括上述核酸组合物、dNTPs、RT-PCRbuffer、酶液和ddH2O。通过采用上述技术方案，可以利用试剂盒对四种B组柯萨奇病毒亚型进行快速分型检测，从而方便了检测工作进行的同时提高了检测工作的效率，且具有实验结果准确，特异性好，重复性好及操作简便的优点。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述RT-PCRbuffer为10×RT-PCRbuffer，所述RT-PCRbuffer包括400mM的tris-base，0.5%的TritonX-100，80mM的MgCl2，5%甘油。通过采用上述技术方案，RT-PCRbuffer能在PCR反应体系中起到缓冲作用，从而能为试剂盒中的酶液提供一个最适合酶催化反应的环境。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。通过采用上述技术方案，dATP、dCTP、dGTP、dUTP这几种核苷酸,将以碱基互补原则,在酶的作用下与上游引物和下游引物进行连接,从而完成RT-PCR的扩增。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述酶液包括逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂以及UDG酶。通过采用上述技术方案，逆转录酶M-MLV为点突变去除了RNaseH的活性中心的逆转录酶，使得RNaseH的活性降低，从而减少了逆转录反应中RNA的降解，提高了cDNA第一链的得率，进而更容易获得全长cDNA。热启动化学修饰TaqDNA聚合酶可以抑制或将PCR反应中的非特异性DNA扩增最小化，而且激活时间更短，活性时间更长，短时间内就可以恢复5’-3’聚合酶活性和5’外切酶活性。RNA酶抑制剂能够抑制作为模板的RNA的降解，提高cDNA第一链的得率，而UDG酶则会对cDNA中的碱基对进行检查，从而减少cDNA中碱基对出现配对错误的可能性，进而提高了探针的识别率。本专利技术在一较佳示例中可以进一步配置为：所述逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂以及UDG酶的比例为1：4：2：3。本专利技术的另一目的在于：提供一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的方法，采用荧光探针RT-PCR法，荧光定量PCR扩增反应体系为：2.5mM/mLdNTPs2μL；10×RT-PCRbuffer2.5μL；50pmol/μLCB2上游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB2下游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB3上游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB3下游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB4上游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB4下游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB5上游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB5下游引物0.1-0.2μL；50pmol/μLCB2探针0.03-0.08μL；50pmol/μLCB3探针0.1-0.15μL；50pmol/μLCB4探针0.05-0.1μL；50pmol/μLCB5探针0.1-0.15μL；酶液0.5-1.5μL；核酸样本0.5~本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物和探针序列：/nCB2上游引物序列 SEQ ID No：1；/nCB2下游引物序列 SEQ ID No：2；/nCB2探针序列 SEQ ID No：3；/nCB3上游引物序列 SEQ ID No：4；/nCB3下游引物序列 SEQ ID No：5；/nCB3探针序列 SEQ ID No：6；/nCB4上游引物序列 SEQ ID No：7；/nCB4下游引物序列 SEQ ID No：8；/nCB4探针序列 SEQ ID No：9；/nCB5上游引物序列 SEQ ID No：10；/nCB5下游引物序列 SEQ ID No：11；/nCB5探针序列 SEQ ID No：12。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的核酸组合物，其特征在于：包括以下引物和探针序列：
CB2上游引物序列SEQIDNo：1；
CB2下游引物序列SEQIDNo：2；
CB2探针序列SEQIDNo：3；
CB3上游引物序列SEQIDNo：4；
CB3下游引物序列SEQIDNo：5；
CB3探针序列SEQIDNo：6；
CB4上游引物序列SEQIDNo：7；
CB4下游引物序列SEQIDNo：8；
CB4探针序列SEQIDNo：9；
CB5上游引物序列SEQIDNo：10；
CB5下游引物序列SEQIDNo：11；
CB5探针序列SEQIDNo：12。


2.一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的核酸组合物、dNTPs、RT-PCRbuffer、酶液和ddH2O。


3.根据权利要求2所述的一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCRbuffer为10×RT-PCRbuffer，所述RT-PCRbuffer包括400mM的tris-base，0.5%的TritonX-100，80mM的MgCl2，5%甘油。


4.根据权利要求2所述的一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述dNTPs包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP。


5.根据权利要求2所述的一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述酶液包括逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂以及UDG酶。


6.根据权利要求5所述的一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的试剂盒，其特征在于：所述逆转录酶M-MLV、热启动化学修饰TaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂以及UDG酶的比例为1：4：2：3。


7.一种同时检测四种B组柯萨奇病毒亚型的方法，其特征在于：采用荧光探针RT-PCR法，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/mLdNTPs2μL；
10×RT-PCRbuffer2.5μL；
50pmol/μL权利要求1CB2上游引物0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1CB2下游引物0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1CB3上游引物0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要求1CB3下游引物0.1-0.2μL；
50pmol/μL权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春兴，李泓彦，
申请(专利权)人：深圳市艾伟迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44