检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途技术

本发明专利技术涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及多瘤病毒的检测。本发明专利技术提供了一种用于检测多瘤病毒并分型的组合物；同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测多瘤病毒并分型的方法。本发明专利技术的组合物能够使用一个管在一次试验中同时检测这3种病毒并分型，其成本低，通量高，耗时少，灵敏度高，特异性好。

【技术实现步骤摘要】
检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
本专利技术涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及多瘤病毒的检测并分型。
技术介绍
多瘤病毒（polyomavirus）是一种广泛分布于脊椎动物体内的病毒，该病毒可在很多不同种系的天然宿主范围内传播，具有促使多种类型细胞发生肿瘤变异的能力。因其可诱发小鼠患多发性肿瘤，因此以“多瘤”一词命名此类病毒多瘤病毒属乳多空病毒科病毒，主要包括BK病毒（BKvirus，BKV）、JC病毒（JCvirus，JCV）和SV40病毒（simianvirus40，猿猴空泡病毒40），原发感染大多发生在儿童和青少年时期，一般无临床症状，但可持续潜伏于肾脏和B淋巴细胞中。当机体免疫功能受损或低下时（AIDS患者、移植受者），潜伏的病毒可被激活，引起活动性感染。可能发展为进行性多灶性白质脑（PML）及多瘤病毒相关性肾病（PVAN）。BK病毒是一种直径45nm，拥有二十面体衣壳的非包膜双链环状DNA病毒，含5300基本碱基对。BK病毒的全部基因有75%与JC病毒同源，70%与SV40病毒同源。BK病毒出现在尿液中称为病毒尿症（viruria），出现在血液或血浆中称为病毒血症（virmia）。BK病毒肾病（BKVN）则定义为BK病毒出现在肾实质中，其伴随证据是肾小管间质性肾炎或爬升的血清肌酐指标，与美国肾移植学组对移植物肾病的定义相一致。BK病毒的治疗不仅是特殊针对肾病的治疗，一些研究学者认为在发现BK病毒血症时便须开始进行干预治疗。所以BK病毒的检测与监控是重要的也是首要措施。JC病毒最早是从进行性多灶性脑白质病患者的大脑组织中分离出来的，这是一种突胶质细胞中病毒裂解复制引起的脱髓鞘疾病，如进行性多灶性白质脑（PML），见于严重细胞免疫抑制病例，如获得性免疫缺陷综合征。SV40病毒（猿猴空泡病毒40），是60年代初发现分离的猴肾细胞病毒，它是一种DNA病毒，其在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成，并且人类许多肿瘤的发生也与之有关。同时，也有研究报道称在患脑瘤的病人的脑组织中，大多数都具有三种病毒中至少一种呈阳性的情况，所以，同时检测并区分这三种病毒是有必要的。目前国内外应用于临床诊断的血清学检测主要是检测抗多瘤病毒的IgG与IgA，检测方法多为酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA技术简单、快速、不需要特定的仪器，但是其灵敏度不高，且存在一定的假阳性。且由于BK病毒/JC病毒/SV40病毒属于长期潜伏感染的病毒，正常人也会携带这些病毒，人抗体90%以上都为阳性，所以血清学的方法并不能有效的判断。而常规的PCR在应用中由于各种因素影响，如操作不规范，标本质量差，严重交叉污染等，都会造成错误的结果，出现假阳性和假阴性。所以更广泛使用的是荧光定量PCR。然而，到目前为止，还未出现同时检测BK病毒、JC病毒，和SV40病毒的荧光定量PCR的产品。现行多瘤病毒的检测主要还是以荧光PCR单通道检测，每次只能检测一个靶标，整体检测的通量与便捷性不够。因此，本领域需要同时检测BK病毒、JC病毒，和SV40病毒的产品。
技术实现思路
有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种检测多瘤病毒并分型的组合物，所述组合物包括：BKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQIDNO:1）；BKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQIDNO:2）；BKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQIDNO:3）；JCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQIDNO:4）；JCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQIDNO:5）；JCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQIDNO:6）；SV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQIDNO:7）；SV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQIDNO:8）；和SV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQIDNO:9）。使用本专利技术的组合物，能够使用一个管在一次试验中同时检测这3种病毒并分型，其成本低，通量高，耗时少，全程仅需75分钟。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。其灵敏度为400拷贝/ml，特异性好。本专利技术的组合物还可以包括上述引物和探针中的一条或多条。所述多瘤病毒包括：BK病毒、JC病毒，和SV40病毒。进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：IC-F1：5'-CAAGATCATCAGCAATGCCT-3'（SEQIDNO:10）；IC-R1：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'（SEQIDNO:11）；和IC-P1：5'-CACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3'（SEQIDNO:12）。进一步地，组合物中的探针（P）的荧光基团不互相干扰。在本专利技术中，“不互相干扰”是指是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些荧光基团的吸光值不接近，能选择不同的检测通道，因而不会互相干扰。在本专利技术中，荧光基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。在一个具体的实施方案中，如SEQIDNO:3所示的BKV探针的荧光基团为FAM；如SEQIDNO:6所示的JCV探针的荧光基团为HEX；如SEQIDNO:9所示的SV40探针的荧光基团为CY5。在一个具体的实施方案中，如SEQIDNO:12所示的内标探针的荧光报告基团为ROX。进一步地，所述组合物中引物（F和R）的用量为25~100nM；所述组合物中探针（P）的用量为10~75nM。在一些实施方案中，本专利技术的组合物存在于同一包装中。第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备用于检测多瘤病毒并分型的试剂盒中的用途。所述多瘤病毒包括：BK病毒、JC病毒，和SV40病毒。第三方面，本专利技术提供了一种检测多瘤病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述本专利技术的组合物。进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、UNG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。进一步地，所述组合物中引物（F和R）的用量为25~100nM；所述组合物中探针（P）的用量为10~75nM；所述dNTP的用量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测多瘤病毒并分型的组合物，所述组合物包括：/nBKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQ ID NO:1）；/nBKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQ ID NO:2）；/nBKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQ ID NO:3）；/nJCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQ ID NO:4）；/nJCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQ ID NO:5）；/nJCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQ ID NO:6）；/nSV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:7）；/nSV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQ ID NO:8）；和/nSV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:9）。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测多瘤病毒并分型的组合物，所述组合物包括：
BKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQIDNO:1）；
BKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQIDNO:2）；
BKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQIDNO:3）；
JCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQIDNO:4）；
JCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQIDNO:5）；
JCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQIDNO:6）；
SV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQIDNO:7）；
SV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQIDNO:8）；和
SV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQIDNO:9）。


2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括：
IC-F1：5'-CAAGATCATCAGCAATGCCT-3'（SEQIDNO:10）；
IC-R1：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'（SEQIDNO:11）；和
IC-...

【专利技术属性】
技术研发人员：范文洲，邱先锋，戴立忠，邓中平，刘佳，纪博知，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43