用于检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒，属于基因检测技术领域。本发明专利技术基于重组酶聚合酶扩增技术建立了一套新型冠状病毒(COVID‑19)恒温快速核酸扩增检测方法，基于这一检测方法构建了恒温快速检测新型冠状病毒ORF基因、N基因的引物探针组合及试剂盒，反应时长仅为18‑20min，具有恒温快速、操作简便的POCT产品特点，比常规RT‑qPCR方法更为省时。

【技术实现步骤摘要】
用于检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒的引物组及试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种新出现的新型冠状病毒，被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”。新型冠状病毒属于冠状病毒β属，为不分节段的单股正链RNA病毒，具包膜，其主要通过飞沫进行传播，传染能力强，感染人后初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现，多数预后良好，部分严重病例可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前仍缺乏针对新冠病毒的有效抗病毒药物。自发现新型冠状病毒肺炎病例以来，这种急性呼吸道传染病传播迅速。自WHO宣布将新型冠状病毒肺炎疫情列为国际关注的突发公共卫生事件以来，新冠肺炎已成为全球性问题。鉴于此，新冠核酸检测需求急剧上升。然而，目前市场上常见的新型冠状病毒核酸检测产品均为普通荧光PCR法检测产品，耗时长，扩增检测过程基本需要1.5～2h，且对仪器及实验室环境要求较高。因此，继续开发一种快速、灵敏度高、特异性强的核酸检测试剂盒，可运用于医院、检验所、出入境、口岸等现场快速筛查。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种用于检测新型冠状病毒的引物组，采用该引物组，可以基于重组酶聚合酶扩增技术，依赖于能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶三种酶在恒温下进行扩增，20min内即可结束反应，且可适用于常见品牌的荧光PCR仪器及恒温荧光扩增仪器等荧光检测设备，具有高效，适应性高的特点。一种用于检测新型冠状病毒的引物组，包括：新型冠状病毒ORF基因特异性引物对和新型冠状病毒N基因特异性引物对，所述ORF基因特异性引物对为：正向引物：5’-GTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG-3’(SEQ.ID.No:1)；反向引物：5’-GTGCCGCACGGTGTAAGACGGGCTGCACTTAC-3’(SEQ.ID.No:2)；所述N基因特异性引物对为：正向引物：5’-AACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGG-3’(SEQ.ID.No:3)；反向引物：5’-GGAGAAGTTCCCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3’(SEQ.ID.No:4)。上述用于检测新型冠状病毒的引物组，根据恒温扩增反应的特点设计，采用上述扩增引物对，可以在恒温且快速的条件下，高效扩增目标基因片段，且不丧失对于检测的精度。具有快速、灵敏度高、特异性强的优势，可广泛运用于医院、检验所、出入境、口岸等需要进行现场快速筛查的领域。在其中一个实施例中，还包括新型冠状病毒ORF基因特异性探针和新型冠状病毒N基因特异性探针；所述ORF基因特异性探针为：5’-TAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGC-3’(SEQ.ID.No:5)；所述N基因特异性探针为：5’-AGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGC-3’(SEQ.ID.No:6)。以上述探针进行检测，具有检测精度高的优势。在其中一个实施例中，所述ORF基因特异性探针在距离5’端34bp处标记四氢呋喃，在四氢呋喃位点上游T碱基标记FAM荧光基团，在四氢呋喃位点下游T碱基标记BHQ1荧光基团，并在3’末端标记C3-spacer修饰基团；所述N基因特异性探针在距离5’端34bp处标记四氢呋喃，在四氢呋喃位点上游T碱基标记FAM荧光基团，在四氢呋喃位点下游T碱基标记BHQ1荧光基团，并在3’末端标记C3-spacer修饰基团。通过上述对探针的优化，提高了探针检测性能。本专利技术还公开了上述的用于检测新型冠状病毒的引物组作为恒温扩增检测试剂在新型冠状病毒检测中的应用。在其中一个实施例中，所述恒温扩增检测的条件为：39～42℃恒温反应18～20min。可以理解的，本专利技术的恒温扩增检测试剂也可用于常规荧光PCR仪器，可将参数条件设置为39～42℃30sec，36～40个循环，并收集荧光。本专利技术还公开了一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括：结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、dNTPs和上述的引物组。本专利技术提供的试剂盒，是利用重组酶聚合酶扩增技术的原理，利用新型冠状病毒ORF基因和N基因的特异性保守区，针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。将新型冠状病毒ORF基因和N基因特异性引物和探针分别放在体系中进行重组酶聚合酶扩增，可以鉴定是否有新型冠状病毒的感染。可以理解的，上述单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、dNTPs等，采用常规商业试剂即可。在其中一个实施例中，所述ORF基因特异性引物对和N基因特异性引物对的浓度均为0.4～0.6μmol/L，所述ORF基因特异性探针和N基因特异性探针的浓度均为0.12～0.15μmol/L，所述dNTP的用量为6～10mmol。在其中一个实施例中，所述结合单链核酸的重组酶的浓度为100～120ng/μL、单链DNA结合蛋白的浓度为80～100ng/μL、链置换DNA聚合酶的浓度为30～35ng/μL。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括：试剂I：反应液缓冲液；试剂II：280mM(mmol/L)的醋酸镁。在其中一个实施例中，该试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为包括新型冠状病毒ORF基因目的片段的假病毒和包括新型冠状病毒N基因目的片段的假病毒，所述假病毒的浓度均为1.0×103～1.0×105copies/μl。在检测时，需要同时进行两种质控品的检测，只有当ORF基因和N基因阳性质控品检测时相应通道荧光信号均呈阳性，阴性质控品检测荧光信号呈阴性时，待检标本的检测结果才算是有效。可以理解的，上述假病毒通过常规方法制备可得，如将新型冠状病毒ORF基因目的片段、新型冠状病毒N目的基因片段分别人工合成后克隆至含有噬菌体基因的表达载体上，通过诱导表达产生被噬菌体衣壳蛋白包被的RNA片段，滴度测定浓度后稀释至1.0×103～1.0×105copies/μl，即得。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的一种用于检测新型冠状病毒的引物组，利用新型冠状病毒ORF基因和N基因的特异性保守区，针对保守区设计靶核苷酸引物和探针，并根据恒温扩增反应的特点设计扩增引物对，可以在恒温且快速的条件下，高效扩增目标基因片段，且不丧失对于检测的精度。本专利技术的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，在重组酶聚合酶扩增技术的基础上，应用能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，以及经过优化处理后的反应Buffer，其完成恒温快速检测时间与普通实时荧光PCR相比从100～120min可缩短至20min，大大提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，包括：新型冠状病毒ORF基因特异性引物对和新型冠状病毒N基因特异性引物对，所述ORF基因特异性引物对为：/n正向引物：5’-GTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG-3’(SEQ.ID.No:1)；/n反向引物：5’-GTGCCGCACGGTGTAAGACGGGCTGCACTTAC-3’(SEQ.ID.No:2)；/n所述N基因特异性引物对为：/n正向引物：5’-AACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGG-3’(SEQ.ID.No:3)；/n反向引物：5’-GGAGAAGTTCCCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3’(SEQ.ID.No:4)。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，包括：新型冠状病毒ORF基因特异性引物对和新型冠状病毒N基因特异性引物对，所述ORF基因特异性引物对为：
正向引物：5’-GTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG-3’(SEQ.ID.No:1)；
反向引物：5’-GTGCCGCACGGTGTAAGACGGGCTGCACTTAC-3’(SEQ.ID.No:2)；
所述N基因特异性引物对为：
正向引物：5’-AACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAAGG-3’(SEQ.ID.No:3)；
反向引物：5’-GGAGAAGTTCCCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3’(SEQ.ID.No:4)。


2.根据权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，还包括新型冠状病毒ORF基因特异性探针和新型冠状病毒N基因特异性探针；所述ORF基因特异性探针为：5’-TAGTTGTGATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGC-3’(SEQ.ID.No:5)；所述N基因特异性探针为：5’-AGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGC-3’(SEQ.ID.No:6)。


3.根据权利要求2所述的用于检测新型冠状病毒的引物组，其特征在于，所述ORF基因特异性探针在距离5’端34bp处标记四氢呋喃，在四氢呋喃位点上游T碱基标记FAM荧光基团，在四氢呋喃位点下游T碱基标记BHQ1荧光基团，并在3’末端标记C3-spacer修饰基团；
所述N基因特异性探针在距离5’端34bp处标记四氢呋喃，在四氢呋喃位点上游T碱基标记FAM荧光基团，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀杰，曹艳，高秀洁，梁建芳，张晓刚，陈廷友，
申请(专利权)人：广州领上源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44