鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒，涉及生物学检测与疾病诊断领域。本发明专利技术的荧光定量PCR鉴定引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。本发明专利技术的鉴定方法包括以下步骤：S1、提取鹦鹉病料组织的病毒RNA，将病毒RNA反转录成cDNA；S2、以步骤S1中cDNA为模板，使用上述鉴定引物进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增；S3、对扩增曲线进行分析，当ct值≤30并且扩增曲线呈S型时，判定为PaBV‑4型阳性，当ct值＞30时，判定为PaBV‑4型阴性。本发明专利技术的引物和鉴定方法，具有灵敏度高，特异性强，重复性好的特点，可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测，尤其适用于鹦鹉博尔纳4型病毒的早期及隐性感染病毒含量低的检测及鉴定。

【技术实现步骤摘要】
鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒
本专利技术涉及生物学检测与疾病诊断领域，特别是涉及一种鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒。
技术介绍
鹦鹉博尔纳病毒(Parrotbornavirus，PaBV)是非分节单股负链，基因组大小约8900bp的RNA病毒，其在细胞核内复制增殖，具有囊膜包被。上世纪70年代，在金刚鹦鹉上报道了一种萎缩病，被称为腺胃扩张症(Proventriculardilatationdisease，PDD)。发生PDD的鹦鹉临床表现主要为严重呕吐，食欲下降，精神沉郁、羽毛松乱，严重时则会出现共济失调，失明或震颤等神经症状。病毒感染侵入消化道神经系统导致胃肠功能紊乱，出现腹泻症状并且不能正常消化食物，在粪便中出现未消化的饲料，有时甚至出现便血。患病鹦鹉因呕吐和胃肠功能紊乱而慢慢消瘦衰竭，最终也常因饥饿或继发细菌感染而死亡，鹦鹉的病死通常在第一次临床症状出现后的15天内发生；也有的鹦鹉在表现出明显的临床症状后，能在几天内就恢复健康状态了而未见反复发病。直到2008年，PDD的致病因子被确定是鹦鹉博尔纳病毒，目前报道的PaBV已有8个基因型，均能感染鹦鹉引起PDD，且发现的病毒嗜性范围更广，病理变化更为复杂。鹦鹉博尔纳病毒的8个基因型中，基因4型(PaBV-4)在世界范围内流行广泛。近年，我国也时有发生鹦鹉感染PaBV-4而引起死亡，但国内少有相关的研究报道。因此，如果能建立一种快速、特异、灵敏的PaBV-4检测方法，对有效防控博尔纳病毒流行，促进鹦鹉养殖的健康发展具有重要意义。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定引物，该PCR鉴定引物是根据PaBV-4的高保守区域M基因设计，能高效、快速、准确地对PaBV-4病毒进行鉴定。一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定引物，所述引物序列如下所示：PaBV4M-F2：GGAGATAGACTTTGTTGGTG(SEQIDNo.1)，PaBV4M-R2：TCGTGTATTTGGAAATAGACG(SEQIDNo.2)。上述引物，是根据PaBV-4的高保守区域M基因设计，能高效、快速、准确地对鹦鹉博尔纳病毒4型进行鉴定。具体地，首先根据病毒基质蛋白基因(M基因)为靶基因从NCBI数据库获取PaBV-4的M基因序列(JX065209.1)，利用Oligo7.0软件设计M基因扩增引物，引物序列如下：PaBV4M-F1：TGAATTCAAAACACACCTACGT(SEQIDNo.3)，PaBV4M-R1：TTAAGGGCCGGAATGGC(SEQIDNo.4)。以PaBV-4cDNA为模板，以PaBV4M-F1(SEQIDNo.3)、PaBV4M-R1(SEQIDNo.4)为引物，PCR扩增M基因片段，该片段大小为429bp，基因序列如下：ATGAATTCAAAACACACCTACGTTGAGCTCAAGGACAAGGTAATTGTTCCTGGATGGCCGACACTGATGCTGGAGATAGACTTTGTTGGTGGGACGTCTCATAACCAATTTATCAACATACCGTTTCTTTCAGTGAAGGAGCCACTTCAGCTTCCAAGGGAGAAGAAGCTTGTGGATTACTTGACAATTGATGTTGAGCCCTCTGGACACTCAACAGTTAACGTCTATTTCCAAATACACGACTTCCTGGTCTTAACTCTCAACTCAATATCTGTATACAAAGATCCGCTCAAACCTTTTATGTTCATTAGACTATCAGAGCAACAAAGCAAACACGCAATCAATGCTGCATTCAACGTATTCTCATTTCGTCTTCGGAACATTGGTGTTGGGCCTTTGGGTCCAGACATACGCCATTCCGGCCCTTAA(SEQIDNo.5)。以M基因序列(SEQIDNo.5)为参考序列，利用Oligo7.0软件设计得到荧光定量PCR鉴定引物PaBV4M-F2(SEQIDNo.1)、PaBV4M-R2(SEQIDNo.2)。本专利技术还提供一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定方法，包括以下步骤：S1、提取鹦鹉病料组织的病毒RNA，将病毒RNA反转录成cDNA；S2、以步骤S1中cDNA为模板，使用如权利要求1中所述的引物PaBV4M-F2、PaBV4M-R2进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增；S3、对扩增曲线进行分析，当ct值≤30并且扩增曲线呈S型时，判定为PaBV-4型阳性；当ct值＞30时，判定为PaBV-4型阴性。上述鉴定方法，能高效、快速、准确地鉴定样品中是否存在PaBV-4的感染，同时还可以反应病毒相对含量，利用这种方法可以对圈养珍稀鸟类如蓝黄金刚鹦鹉、绿翅金刚鹦鹉等鹦鹉博尔纳4型病毒的及时检测起到重要作用。在其中一个实施例中，所述cDNA含量≥6.7×102拷贝/μL。在其中一个实施例中，所述步骤S1中，采用AxyPrepBodyFluidViralDNA/RNAMiniprepKit250-prepRNA提取试剂盒、PeimeScript反转录试剂盒制备cDNA样本在其中一个实施例中，所述步骤S2的PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，30个循环；95℃变性30s；53.7℃退火30s；72℃延伸20s；72℃延伸10min。在其中一个实施例中，所述步骤S2的PCR扩增反应体系包括以下组分：TBGreenPremixExTaqⅡ、引物PaBV4M-F2和PaBV4M-R2、ddH2O、cDNA模板。在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应体系为25μL，具体包括：本专利技术还提供一种用于鉴定鹦鹉博尔纳病毒4型的试剂盒，包括以下组分：TBGreenPremixExTaqⅡ、PaBV4M-F2、PaBV4M-R2、ddH2O、cDNA模板。上述试剂盒，能精确、高效、快速鉴定样品中是否存在PaBV-4型的感染，敏感性最低可检测为6.7×102拷贝/μL，比普通PCR检测高100倍。本专利技术还提供一种上述试剂盒在鉴定鹦鹉博尔纳病毒基因型中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的引物序列，是根据PaBV-4的高保守区域M基因设计，能高效、快速、准确地对鹦鹉博尔纳病毒4型进行鉴定。利用本专利技术的荧光定量PCR鉴定方法，可准确诊断鹦鹉是否存在该种病毒感染，尤其适用于鹦鹉博尔纳4型病毒的早期及隐性感染病毒含量低的检测及鉴定，为鹦鹉博尔纳病毒的临床诊断及分子流行病学调查提供了一种可靠的方法，对于该基因型博尔纳病毒的预防具有重要的临床意义。附图说明图1为SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR敏感试验结果；其中，1～6：6.7×106～本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：/nPaBV4M-F2：GGAGATAGACTTTGTTGGTG(SEQ ID No.1)，/nPaBV4M-R2：TCGTGTATTTGGAAATAGACG(SEQ ID No.2)。/n

【技术特征摘要】
1.一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定引物，其特征在于，所述引物序列如下所示：
PaBV4M-F2：GGAGATAGACTTTGTTGGTG(SEQIDNo.1)，
PaBV4M-R2：TCGTGTATTTGGAAATAGACG(SEQIDNo.2)。


2.一种鹦鹉博尔纳病毒4型的荧光定量PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取鹦鹉病料组织的病毒RNA，将病毒RNA反转录成cDNA；
S2、以步骤S1中cDNA为模板，使用如权利要求1中所述的引物PaBV4M-F2、PaBV4M-R2进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增；
S3、对扩增曲线进行分析，当ct值≤30并且扩增曲线呈S型时，判定为PaBV-4型阳性；当ct值＞30时，判定为PaBV-4型阴性。


3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR鉴定方法，其特征在于，所述cDNA含量≥6.7×102拷贝/μL。


4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用AxyPrepBodyFluidViralDNA/RNAMiniprepKit250-pre...

【专利技术属性】
技术研发人员：单芬，黎金荣，焦培荣，李婉萍，翟俊琼，代军威，陈武，
申请(专利权)人：广州动物园，
类型：发明
国别省市：广东;44