【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及一种用于鉴定天鹅性别的rpa引物、试剂盒及应用。
技术介绍
1、天鹅别称鸿鹄，是雁形目鸭科天鹅属的一种大型水禽，雌雄体态及羽毛色泽基本一致，外观区别不十分明显，单凭肉眼观察比较难以分辨雌雄，其中，黑天鹅(学名：cygnusatratus)属于雁形目天鹅科，原产于澳大利亚塔斯马尼亚州和新西兰，属于单态性鸟类，在外观和和其他行为特点也都难以区分雌雄。
2、传统性别鉴定的方法是通过观察黑天鹅的泄殖腔形态差异进行鉴定，而此种判断方法对黑天鹅的应激较大，主观性强，还具有侵入性和危害性，严重还会导致不育或死亡。随着分子技术的发展，pcr等分子鉴定技术已为黑天鹅性别鉴定提供了工具，但是常规的pcr方法设备要求较高，耗时长，对操作人员专业素质要求高，该方法也难以普及于一般动物园或饲养场。然而在动物园的饲养、管理工作中，需要能快速准确无创对黑天鹅进行性别鉴定，才能更有利于饲养管理、繁殖与育种、遗传疾病的防治、种群结构和种群遗传分析，更有利于加强饲养管理同时降低饲养成本，提高经济效益。因此，亟需一种快速鉴别黑天鹅性别且伤害性较小的方法。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供一种用于天鹅性别鉴定的引物，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴定天鹅性别的rpa引物，包括：
3、上游引物：5’-agaggag
4、下游引物：5’-aaaccatccaacacagaagtacaagccaaa-3’(seq id no：8)。
5、重组酶聚合酶恒温扩增技术(recombinase polymerase amplification；rpa)是一种由重组酶、单链dna结合蛋白和链置换dna聚合酶参与的恒温扩增技术，在37℃-42℃下进行20-30分钟即可完成扩增，具有特异性强、与pcr灵敏度一致、操作简便、对仪器设备要求低等优点。目前，rpa检测技术已经广泛应用在临床中快速检测病毒、细菌和寄生虫等，然而将rpa技术应用于鉴别天鹅性别时，并非任意功能性基因片段就能实现较好的扩增、鉴定效果。本专利技术人选择黑天鹅基因组中雌雄存在差异的z与w染色体螺旋蛋白基因(chromo-helicase-dnabinding gene，chd)序列作为目的扩增片段，然而在进一步研究过程中，本专利技术人发现并非任意以chd为目的扩增片段的引物序列均能实现较好的性别鉴定，本专利技术人经过实验后，提出上述rpa引物，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。
6、本专利技术还提供了所述的rpa引物在制备用于鉴定天鹅性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
7、本专利技术还提供了一种用于鉴定天鹅性别的试剂盒，包括所述rpa引物。
8、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括rpa反应体系，所述rpa反应体系包括重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶和所述rpa引物。
9、在其中一个实施例中，所述rpa引物的工作浓度为0.15-0.25μm。
10、所述工作浓度为上述rpa引物在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述rpa引物的产品时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本专利技术的保护范围之内。在其中一个实施例中，所述rpa反应体系还包括：反应缓冲液、醋酸镁溶液、雌性阳性模板、雄性阳性模板。
11、本专利技术还提供了一种天鹅性别鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测样本的dna，进行pcr扩增反应，采用所述试剂盒进行rpa反应。
12、将利用上述引物的试剂盒与rpa扩增法结合，借助雌性黑天鹅w染色体和雄性黑天鹅z染色体的序列差异得到的天鹅性别鉴定方法，简单快速、准确无创，结果判定的电泳条带清晰明亮，且比常规pcr耗时短。
13、在其中一个实施例中，所述天鹅性别鉴定的方法还包括采用所述试剂盒进行rpa反应得到rpa反应产物后，对rpa反应产物进行电泳分析。
14、在其中一个实施例中，所述电泳分析包括以下步骤：将所述rpa反应产物进行纯化，进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果判断天鹅性别。
15、在其中一个实施例中，所述判断天鹅性别的方法包括：所述检测结果为在149bp处出现电泳条带，所述待测样本来源于雌性天鹅；所述检测结果为在240bp处出现电泳条带，所述待测样本来源于雄性天鹅。
16、在其中一个实施例中，所述rpa反应的条件为：将所述rpa反应体系混合后，在37-42℃下反应3-7min，混匀，离心，在37-42℃下反应20-30min，置于冰上终止反应。
17、在其中一个实施例中，所述pcr扩增反应的扩增引物包括第一引物组和/或第二引物组；
18、所述第一引物组包括：chd-w-f：agaggaggaaagacaaaaag(seq id no：9)，chd-w-r：tttccattaaagctaatctg(seq id no：10)；
19、所述第二引物组包括：chd-z-f：agaggaggaaagacaaaaag(seq id no：11)，chd-z-r：cttccattggagctgatc(seq id no：12)。
20、在其中一个实施例中，所述pcr扩增反应的条件为：92-96℃预变性2.5-3.5min；92-96℃变性28-32s，53-57℃退火28-32s，70-75℃延伸28-32s，共35个循环；70-75℃再延伸4.5-5.5min。
21、在其中一个实施例中，所述天鹅包括黑天鹅，所述待测样本包括羽毛。
22、在其中一个实施例中，所述待测样本包括羽毛根部。
23、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
24、本专利技术的一种用于天鹅性别鉴定的引物、试剂盒及应用，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。
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1.一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物，其特征在于，包括：
2.权利要求1所述的RPA引物在制备用于鉴定天鹅性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
3.一种用于鉴定天鹅性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA反应体系，所述RPA反应体系包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和权利要求1所述的RPA引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA引物的工作浓度为0.15-0.25μM。
6.一种天鹅性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，进行PCR扩增反应，采用权利要求3-5中任一项所述的试剂盒进行RPA反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA反应的条件为：将所述RPA反应体系混合后，在37-42℃下反应3-7min，混匀，离心，在37-42℃下反应20-30min，置于冰上终止反应。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的扩增引物包括第一引物
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：92-96℃预变性2.5-3.5min；92-96℃变性28-32s，53-57℃退火28-32s，70-75℃延伸28-32s，共35个循环；70-75℃再延伸4.5-5.5min。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述天鹅包括黑天鹅，所述待测样本包括羽毛。
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定天鹅性别的rpa引物，其特征在于，包括：
2.权利要求1所述的rpa引物在制备用于鉴定天鹅性别的试剂和/或试剂盒中的应用。
3.一种用于鉴定天鹅性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的rpa引物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括rpa反应体系，所述rpa反应体系包括重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶和权利要求1所述的rpa引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述rpa引物的工作浓度为0.15-0.25μm。
6.一种天鹅性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的dna，进行pcr扩增反应，采用权利要求3-5中任一项所述的试剂盒进行rpa反应。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：曾繁文，陈谭子芃，陈绚姣，黄康，黄勉，吴其锐，
申请(专利权)人：广州动物园，
类型：发明
国别省市：
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