【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于马铃薯病菌防治，具体涉及一种马铃薯晚疫病防治方法。
技术介绍
1、马铃薯晚疫病是全球的第一大作物病害，一旦发病会在短时间内大面积摧毁马铃薯而导致大幅减产，甚至是绝收，严重制约马铃薯产业经济的发展。致病疫霉是马铃薯晚疫病的病原菌，其隶属于半活体营养型致病菌，主要侵染马铃薯、番茄、茄子、辣椒等多种茄科茄属植物。致病疫霉侵染分为两个阶段：致病疫霉侵入活体细胞早期并不会导致宿主细胞的立即死亡，并且该阶段的活动也不会导致宿主产生明显的症状，因此称为活体营养阶段；随着病原菌不断入侵，菌丝不断地增长，并产生大量孢子，致使入侵位点出现明显病斑，并且快速扩大，从而导致宿主细胞以及机体的死亡，称为死体营养寄生阶段。
2、面对病原微生物的入侵，植物采取积极的pti免疫应答反应，但是一些具有较强致病力的病原微生物通过再次向植物细胞内分泌多种effctors来抑制宿主免疫。一方面effctors直接与prrs相互作用以抑制植物pti免疫应答反应，另一方面干扰prrs介导的细胞内部抗病信号转导，以促进自身侵染（effector triggered susceptibility，ets）。为阻止病原菌以这样方式入侵，植物进化出第二道防线，即效应因子触发的植物免疫响应（eti）。植物eti响应是一个快速且特异性强的过程，effectors被r蛋白特异性识别后，通常在病原菌侵染部位产生大量ros，引发hr反应，促进细胞程序性死亡，防止病原菌向周围扩张。
3、病原菌可通过将效应因子输送至植物细胞与植物蛋白相互作用从而增强植物抗
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种马铃薯晚疫病防治方法，以马铃薯晚疫病为核心，以“马铃薯-致病疫霉”为“宿主-病原菌”互作模式系统，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种马铃薯晚疫病防治方法，包括：选择菌种和植物材料，所述菌种包括致病疫霉、农杆菌、大肠杆菌和酿酒酵母，所述植物材料包括马铃薯鄂薯、哥伦比亚生态型拟南芥和本氏烟草；进行载体构建和酵母双杂交，筛选互作蛋白；通过亚细胞定位和bifc分析后进行农杆菌介导的马铃薯和拟南芥遗传转化，进行晚疫病菌侵染实验；对试验结果进行分析，分析结果包括：rxlr效应子piavrblb2促进致病疫霉侵染、piavrblb2-1与马铃薯核糖体蛋白s6激酶互作、sts6k2正向调控马铃薯对晚疫病的抗性、sts6k2与马铃薯转录因子wrky59互作、stwrky59正向调控马铃薯对晚疫病的抗性、stwrky59综合调控宿主与晚疫病抗性相关基因的表达；根据所述分析结果对马铃薯晚疫病进行防治。
3、优选地，所述致病疫霉用于马铃薯抗病性检测，培养于黑麦培养基中，培养温度为20℃；所述农杆菌用于农杆菌介导的遗传转化；所述大肠杆菌用于载体构建，均培养于lb培养基；所述酿酒酵母用于蛋白互作验证，培养于ypda培养基、二缺培养基、四缺培养基中。
4、优选地，所述马铃薯鄂薯、哥伦比亚生态型拟南芥和本氏烟草的培养条件为25℃，光照16h/黑暗8h，相对湿度65%。
5、优选地，所述载体构建包括：使用gateway克隆系统构建由植物组成型启动子camv35s驱动的sts6k2、stwrky59和piavrblb2的过表达载体和rnai载体，用于亚细胞定位分析及后续的遗传转化。
6、优选地，所述酵母双杂交，包括：选5μl煮沸后的carrierdna、1μlpgadt7-sts6k2和1μlpgbkt7-stwrky59混匀后与50μl酵母y2hgold感受态细胞混匀；加入500μlpeg3350/lica混匀，30℃水浴10min，重复3次；加入20μldmso，42℃水浴5min，重复4次；5000rpm离心1min，弃上清加入500μl无菌水混匀；5000rpm离心1min，加入500μlypda，28℃、180rpm培养2-3h；5000rpm离心1min，弃上清加入1ml无菌水，5000rpm离心1min，重复一次；加入200μl无菌水混匀，涂布在sd-leu-trp培养基上，培养2-3d，二缺培养基上单克隆转到sd-leu-trp-ade-his培养基上，培养至出现单克隆。
7、优选地，所述亚细胞定位，包括：选择3-4周龄烟草，提前12h浇透水备用；转基因农杆菌提前一天活化，活化后的农杆菌按500μl接种到50ml液体lb培养基中培养，1000g离心10min，弃上清，加入转染液，静置1h；注射烟草，25℃暗培养1d，转入16h光照、22℃，8h黑暗、20℃条件下培养1d；选择侵染位点周围叶片制片，荧光倒置显微镜观察表达效果，用激光共聚焦显微镜拍摄。
8、优选地，所述农杆菌介导的马铃薯和拟南芥遗传转化，包括：将活化后的农杆菌按1%的比例接种到lb液体培养基中培养，1000g离心10min，用ms液体培养基重悬，od600调整至0.5，28℃，180rpm培养1h；取3-4周龄desiree野生型马铃薯，取茎段剪成1-2cm长置于ms液体培养基，每个转基因农杆菌对应约100根茎段；取1ml农杆菌悬浮液加入茎段中混匀，并封口，22℃，50rpm摇床中培养45min；滤纸吸干茎段上的培养基后将茎段转到cm平板上，暗培养2d；将茎段转入含250mg/lcef+的cmc平板上，光照16h、24℃，8h、20℃周期培养12d；将茎段转入含100mg/lkan+的cmck平板上，光照16h、24℃，8h、20℃周期培养14d，14d后更换cmck平板，在茎段膨大处长出茎，将其转入含抗生素的sm培养基中筛选阳性植株。
9、优选地，所述晚疫病菌侵染实验，包括：用无菌水冲洗培养15天的t30-4平板，获取孢子囊悬浮液，并将浓度调至107孢子囊/ml备用；实验盘用75%酒精消毒后，铺上滤纸，在滤纸上喷上无菌水使滤纸湿透，取拟南芥、马铃薯或烟草叶片平铺在盘子中，接菌处用无菌注射器扎孔；接种20μl孢子悬浮液到野生型或转基因的离体叶片背面，保鲜膜密封，所有叶片暗培养24h后转入16h光照、22℃，8h黑暗、20℃条件下培养，相对湿度保持在90%以上；用dab和苯胺蓝染色分别检测侵染部位活性氧和胼胝质的积累情况，并用紫外吸收法测定其含量，每试验重复3次，每重复至少包含10片叶片。
10、本专利技术的技术效果和优点：本专利技术提出的一种马铃薯晚疫病防治方法，与现有技术相比，具有以下优点：
11、本专利技术以马铃薯晚疫病为核心，以“马铃薯-致病疫霉”为“宿主-病原菌”互作模式系统，从病原菌的效应因子出发，通过酵母双杂交、双分子荧光互补和基因功能验证等实验发现致病疫霉效应因子piavrblb2-1靶向马铃薯核糖体蛋白s6激酶，进而调控转录因子wrky59的活性，从而抑制宿主免疫反应，促进疫霉侵染，为病原-宿主互作机制提供新认识，为抗性品种培育提供新基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述致病疫霉用于马铃薯抗病性检测，培养于黑麦培养基中，培养温度为20℃；所述农杆菌用于农杆菌介导的遗传转化；所述大肠杆菌用于载体构建，均培养于LB培养基；所述酿酒酵母用于蛋白互作验证，培养于YPDA培养基、二缺培养基、四缺培养基中。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述马铃薯鄂薯、哥伦比亚生态型拟南芥和本氏烟草的培养条件为25℃，光照16h/黑暗8h，相对湿度65%。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述载体构建包括：使用Gateway克隆系统构建由植物组成型启动子CaMV35S驱动的StS6K2、StWRKY59和PiAvrblb2的过表达载体和RNAi载体，用于亚细胞定位分析及后续的遗传转化。
5.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述酵母双杂交，包括：
6.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述亚细
7.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述农杆菌介导的马铃薯和拟南芥遗传转化，包括：
8.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述晚疫病菌侵染实验，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述致病疫霉用于马铃薯抗病性检测，培养于黑麦培养基中，培养温度为20℃；所述农杆菌用于农杆菌介导的遗传转化；所述大肠杆菌用于载体构建，均培养于lb培养基；所述酿酒酵母用于蛋白互作验证，培养于ypda培养基、二缺培养基、四缺培养基中。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述马铃薯鄂薯、哥伦比亚生态型拟南芥和本氏烟草的培养条件为25℃，光照16h/黑暗8h，相对湿度65%。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯晚疫病防治方法，其特征在于，所述载...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗秀媚，任茂智，
申请(专利权)人：中国农业科学院都市农业研究所，
类型：发明
国别省市：
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