一种鹿茸细胞悬浮驯化方法技术

技术编号：40426478 阅读：5 留言：0更新日期：2024-02-20 22:47

本发明专利技术公开了一种鹿茸细胞悬浮驯化方法，包括贴壁阶段培养基(Mix1)：KBM 581培养基+10％FBS+20ng/mL FGF2+1g/L rBSA、悬浮阶段培养基(Mix2)：50％Mix1+50％倍谙基SF501培养基+0.1％PF68+50mg/mL硫酸葡聚糖，主要包括以下步骤：ASC贴壁培养传代驯化，将原始的完全培养基逐步过渡至适合细胞悬浮的MIX 1培养基：将鹿茸干细胞ASC复苏，用标准细胞培养塑料器皿和完全培养基1，按1×105cells/mL的浓度接种，培养体积为5mL，细胞接种数量为5×105cells/T25方瓶，连续传代3次。本发明专利技术通过改进培养条件和悬浮培养技术，提高鹿茸细胞的增殖速率，实现高效生产，通过产品提取和纯化，获得高纯度的鹿茸生物制品，减少了对天然鹿茸的依赖，有助于保护生态环境，适用于医药、保健品和化妆品等领域，满足不同市场需求。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种鹿茸细胞悬浮驯化方法。

技术介绍

1、鹿茸是鹿角的生长末端组织，含有大量活性物质，如细胞因子、生长因子和胶原蛋白等。鹿茸具有多种药用和保健功能，例如，抗疲劳、增强免疫力、促进伤口愈合等。传统上，鹿茸主要以天然采集的方式获取，但这种方式存在生态破坏和供应不足的问题。因此，鹿茸细胞的体外培养具有巨大的潜力，可以满足市场需求。然而，鹿茸细胞的体外培养受到多种因素的制约，如细胞的增殖速率低、细胞凋亡率高等。传统的培养方法难以满足工业生产的需要，需要一种更有效的培养方法，以提高鹿茸细胞的生产效率。

技术实现思路

1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种鹿茸细胞悬浮驯化方法。

2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：

3、本专利技术一种鹿茸细胞悬浮驯化方法，包括贴壁阶段培养基(mix1)：kbm581培养基+10％fbs+20ng/ml fgf2+1g/l rbsa、悬浮阶段培养基(mix2)：50％mix1+50％倍谙基sf501培养基+0.1％pf68+50mg/ml硫酸葡聚糖，主要包括以下步骤：

4、asc贴壁培养传代驯化，将原始的完全培养基逐步过渡至适合细胞悬浮的mix 1培养基：

5、1)：将鹿茸干细胞asc复苏，用标准细胞培养塑料器皿(t25烧瓶)和完全培养基1(α-mem+10％fbs+10ng/ml fgf2)，按1×105cells/ml的浓度接种，培

6、2)第4-10代传代培养时，将贴壁培养基替换为50％完全培养基1+50％mix1培养基，让细胞逐步适应mix 1培养基；

7、3)第11-16代传代培养时，将培养基完全替换成mix 1培养，期间观察细胞形态变化，计数测定细胞的倍增时间和活率，当细胞的倍增时间和完全培养基一致，且细胞形态不发生明显改变时，将驯化完成的细胞扩增冻存，建立细胞库；

8、asc悬浮培养传代驯化：将适应mix 1培养基的asc贴壁细胞驯化成可以适应悬浮培养的细胞：

9、1)复苏一支经过贴壁驯化的asc细胞，用标准细胞培养塑料器皿(t75烧瓶)和mix1培养基，按1×105cells/ml的浓度接种，培养体积为15ml，细胞接种数量为1.5×106cells/t75方瓶，连续传代扩增3次。

10、2)培养到第4代时，当细胞汇合度达到80％-90％时，将细胞消化终止后，1000g离心5分钟，离心完成后用mix 2培养基(mix1+f68+硫酸葡聚糖+rbsa+葡萄糖)重悬，以1×105cells/ml的密度将细胞接种至表面未处理的t75方瓶中静态悬浮培养，培养72小时后，将细胞离心收集，用mix 1培养基重悬后接入表面处理过的t75方瓶贴壁培养，按照上述步骤进行重复的静态悬浮-转贴壁-转静态悬浮10代以上；

11、3)观察细胞形态变化，当细胞贴壁培养时，较之前呈现更加圆、体积更小时，用mix1培养基扩增3个t75方瓶的asc细胞，当细胞汇合度达到80％-90％时，将细胞离心后用mix2培养基重悬，以2×105cells/ml的密度将细胞接种至125ml的摇瓶中，培养体积为30ml，在二氧化碳摇床中进行培养，培养条件：温度为37℃、摇床速度为65rpm@50mm、二氧化碳浓度为5％、相对湿度为80％；

12、4)悬浮培养72小时后，观察细胞形态，当有较大细胞团时，用移液枪进行轻柔的吹打，然后用40um的筛网进行过滤，将过滤后的细胞进行计数；

13、5)若活细胞密度低于接种密度2×105cells/ml时，按1×105cells/ml的浓度接种，培养体积15ml，细胞接种数量为1.5×106cells/t75方瓶，将细胞重新贴壁培养，细胞贴壁扩增后，按上述条件重新进行摇瓶悬浮培养，直至细胞悬浮增殖；

14、6)若活细胞密度大于接种密度2×105cells/ml时，则按原接种密度进行悬浮传代培养，传代10次后，当细胞连续6代以上稳定增殖时，细胞已经适应了悬浮培养条件。

15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：

16、本专利技术通过改进培养条件和悬浮培养技术，提高鹿茸细胞的增殖速率，实现高效生产，通过产品提取和纯化，获得高纯度的鹿茸生物制品，减少了对天然鹿茸的依赖，有助于保护生态环境，适用于医药、保健品和化妆品等领域，满足不同市场需求。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种鹿茸细胞悬浮驯化方法，其特征在于，包括贴壁阶段培养基(Mix1)：KBM 581培养基+10％FBS+20ng/mL FGF2+1g/L rBSA、悬浮阶段培养基(Mix2)：50％Mix1+50％倍谙基SF501培养基+0.1％PF68+50mg/mL硫酸葡聚糖，主要包括以下步骤：

【技术特征摘要】

1.一种鹿茸细胞悬浮驯化方法，其特征在于，包括贴壁阶段培养基(mix1)：kbm 581培养基+10％fbs+20ng/ml fgf2+1g/l ...

【专利技术属性】
技术研发人员：董浩然，邹灵，曹哲厚，
申请(专利权)人：杭州极麋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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