一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法技术

本发明专利技术公开一种自发永生化鹿茸干细胞系制备方法，主要包括以下步骤：获取鹿茸干细胞：分离提取：选择三岁壮年梅花鹿二杠鹿茸，排出鲜血后冷藏带至实验室；用

【技术实现步骤摘要】
一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞制备，特别涉及一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法
。

技术介绍

[0002]众所周知，鹿茸本身作为保健食品，已被多方研究和证实其功效
。
[0003]鹿茸是哺乳动物中唯一能在自然情况下周期性完全再生的器官，富含丰富的活性多肽
、
蛋白质
、
脑磷脂及多种人体所必需的微量元素和矿物质等营养成分，且最具价值的鹿茸干细胞仅少量存在于鹿茸尖部，传统鹿茸价格昂贵，高达7万
/
公斤，使用本专利技术方法，可获得鹿茸中发挥最大功效的干细胞，保留原始鹿茸的营养价值，不经过基因编辑，并可应用于多种形式食品及保健品或抗衰老领域，成本可降至十分之一，传统的鹿茸干细胞制备方法，鹿茸干细胞的稳定性差，存在鹿茸干细胞在体外大规模培养及应用中所面临的活率低，增值慢，储备需要重复提取的问题
。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法
。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0006]本专利技术一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法，主要包括以下步骤：
[0007]1)
获取鹿茸干细胞：
[0008]分离提取：选择三岁壮年梅花鹿二杠鹿茸，排出鲜血后冷藏带至实验室；用
75
％比例酒精清洗鹿茸，再用生理盐水洗涤，重复两次；r/>PBS(2
％双抗
)
清洗鹿茸，重复三次，转至生物安全柜；生物安全柜内再次
PBS(2
％双抗
)
清洗；将鹿茸组织切片，去除鹿茸皮，同时再次清洗，用胶头滴管吸取
PbS
冲洗组织块后收集并
400g
离心十分钟
。
弃上清液取沉淀，用
PBS
重悬再次离心，重复三次
。
取沉淀，用自研培养基重悬，计数后铺板，置于
38.5c
培养箱中培养；
[0009]2)
自研适合鹿茸干细胞生长的培养基
:
[0010]自研培养基是由
DMEM
基础培养基与其他组分组合而成，补充有酵母浸粉，小麦低聚肽，乳清蛋白肽，
5mM
非必需氨基酸，
5mM L
‑
谷氨酰胺，
3M 100
‑
巯基乙醇，此外培养基包含盐
、
维生素
、
能量源
、
矿物质，多肽和氨基酸以及合适鹿茸细胞生长的因子包含
GABA
，哌胆酸，氯化锂和转化生长因子
β
和碱性成纤维细胞生长因子
、
血小板衍生生长因子
、
表皮生长因子，肝细胞生长因子，神经营养因子，成纤维细胞生长因子；
[0011]3)
自发永生化过程
:
[0012]ADC
，
ASC
留三分之一传代；
6cm
培养皿进行原代鹿茸细胞诱导，加入
4mlPBS
和
4ml
亚甲基蓝，避光
30
分钟，光照
30
分钟，后换自研培养基培养；在
38.5c
培养箱中静置一天；重复更换自研培养基，继续诱导并传代，继续静置；筛选细胞并继续传代，直至传到
50
代
。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0014]1：本专利技术提高鹿茸干细胞的稳定性，为解决鹿茸干细胞在体外培养及扩增应用中
遇到的增值慢，活率低等问题，配合自研的培养基，增加多种植物来源成分替代常规培养基中的组分，用于增强鹿茸干细胞活率，加快增值速率，延长细胞的传代次数，从而实现细胞永生化
。
同时通过细胞形态鉴定，蛋白免疫荧光，流式细胞术等方法鉴定鹿茸干细胞永生化的生物学特性
。
附图说明
[0015]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制
。
在附图中：
[0016]图1是本专利技术的原代细胞及永生化后细胞形态对比图；
[0017]图2是本专利技术的细胞鉴定图；
具体实施方式
[0018]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术
。
[0019]实施例1[0020]如图1‑2所示，本专利技术提供一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法，主要包括以下步骤：
[0021]1、
用
10mm
亚甲基蓝诱导
ADC、ASC、Myo
，进行分化；
[0022]2、
分化后培养获得永生化鹿茸干细胞系；
[0023]具体实施方案：
[0024]获取鹿茸干细胞的方法
[0025]分离提取：
[0026]1、
选择三岁壮年梅花鹿二杠鹿茸，排出鲜血后冷藏带至实验室；
[0027]2、
用
75
％比例酒精清洗鹿茸，再用生理盐水洗涤，重复两次
。
[0028]3、PBS(2
％双抗
)
清洗鹿茸，重复三次，转至生物安全柜；
[0029]4、
生物安全柜内再次
PBS(2
％双抗
)
清洗；
[0030]5、
将鹿茸组织切片，去除鹿茸皮，同时再次清洗，用胶头滴管吸取
PbS
冲洗组织块后收集并
400g
离心十分钟
。
弃上清液取沉淀，用
PBS
重悬再次离心，重复三次
。
取沉淀，用自研培养基重悬，计数后铺板，置于
38.5c
培养箱中培养
。
[0031]自研适合鹿茸干细胞生长的培养基
[0032]自研培养基是由
DMEM
基础培养基与其他组分组合而成，补充有酵母浸粉，小麦低聚肽，乳清蛋白肽，
5mM
非必需氨基酸，
5mM L
‑
谷氨酰胺，
3M 100
‑
巯基乙醇，此外培养基包含盐
、
维生素
、
能量源
(
如葡萄糖
)、
矿物质，多肽和氨基酸以及合适鹿茸细胞生长的因子包含
GABA
，哌胆酸，氯化锂和转化生长因子
β
(TGFR)
和
bFGF(
碱性成纤维细胞生长因子
)、PDGF(
血小板衍生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种自发永生化的鹿茸干细胞制备方法，主要包括以下步骤：
1)
获取鹿茸干细胞：分离提取：选择三岁壮年梅花鹿二杠鹿茸，排出鲜血后冷藏带至实验室；用
75
％比例酒精清洗鹿茸，再用生理盐水洗涤，重复两次；
PBS(2
％双抗
)
清洗鹿茸，重复三次，转至生物安全柜；生物安全柜内再次
PBS(2
％双抗
)
清洗；将鹿茸组织切片，去除鹿茸皮，同时再次清洗，用胶头滴管吸取
PbS
冲洗组织块后收集并
400g
离心十分钟
。
弃上清液取沉淀，用
PBS
重悬再次离心，重复三次
。
取沉淀，用自研培养基重悬，计数后铺板，置于
38.5c
培养箱中培养；
2)
自研适合鹿茸干细胞生长的培养基
:
自研培养基是由
DMEM
基础培养基与其他组分组合而成，补充有酵母浸粉，小麦低聚肽，乳清蛋白肽，
5mM
非必需氨基酸，
5...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋亦旭，邹灵，曹哲厚，
申请(专利权)人：杭州极麋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：