红色诺卡氏菌细胞壁骨架在皮瓣移植术中的用途制造技术

本公开涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在皮瓣移植术中的用途。本公开提供一种经红色诺卡氏菌细胞壁骨架培养的间充质干细胞、及其提取的外泌体、以及包含外泌体的药物组合物。本公开的外泌体或药物组合物能够增强移植皮瓣的血管生成，使皮瓣成活率更高，改善皮瓣成活后的外观，提高皮瓣移植术的成功率。提高皮瓣移植术的成功率。

【技术实现步骤摘要】
红色诺卡氏菌细胞壁骨架在皮瓣移植术中的用途


[0001]本公开涉及医学、生物制药领域。具体而言，本公开涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在皮瓣移植术中的用途。

技术介绍

[0002]红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)是诺卡氏菌中的一种。红色诺卡氏菌的菌体经发酵、细胞破碎、蛋白酶降解后可制得红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
[0003]现有技术中，红色诺卡氏菌细胞壁骨架可以是市售获得，具体而言由辽宁格瑞仕特生物制药有限公司生产的商品(Nr
‑
CWS)。红色诺卡氏菌细胞壁骨架已用于治疗宫颈糜烂、宫颈癌前病变(CN101073583A)、抗人乳头瘤病毒(CN1935262A)、皮肤损伤或皮肤溃疡(CN101209267A)、真菌感染、单纯疱疹、带状疱疹(CN1879661A)。证实了红色诺卡氏细胞壁骨架拥有降低炎症反应、促进皮肤组织再生的优势。
[0004]目前，皮瓣移植术是修复各种类型皮肤缺损重要且常规的临床治疗方法之一。但是，皮瓣移植术之后，经常会出现皮瓣缺血坏死、皮瓣挛缩、色素沉着等问题。如何解决这些问题，仍然是一项巨大的挑战。
[0005]近年来，众多细胞产物得到临床的关注。对外泌体的研究越来越受到重视。外泌体以其低免疫原性、高效的生物活性，在创面修复、皮肤组织再生中日益成熟。但是，由于外泌体提取程序复杂、产量低，限制了其在临床上的广泛应用。
[0006]然而，现有技术中尚未有报道红色诺卡氏菌细胞壁骨架联合外泌体在皮瓣移植术中的应用。

技术实现思路

[0007]第一方面，本公开提供了一种间充质干细胞的外泌体。
[0008]外泌体(exosome)是指包含了RNA和蛋白质，且直径在40至100nm的囊泡。
[0009]多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。体外培养的细胞类型也可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液(包括血液、唾液、尿液、脑脊液)中。
[0010]间充质干细胞的外泌体是指：间充质干细胞培养时所分泌的外泌体。
[0011]在一些实施方案中，所述间充质干细胞选自以下的任一项：脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、肝脏间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、牙髓间充质干细胞。
[0012]在一些具体实施方案中，所述间充质干细胞是经红色诺卡氏菌细胞壁骨架培养的间充质干细胞。
[0013]红色诺卡氏菌是指Nocardia属的红色诺卡氏菌种(Nocardiarubra)。
[0014]红色诺卡氏菌的鉴定：根据已知的或未来的微生物鉴定技术，技术人员可以对一
株细菌进行分类学鉴定，例如可用的鉴定技术包括形态学、生理生化特征、16S rRNA等。技术人员理解，随着科技的发展，鉴定技术涉及不同的手段，在较早的时期主要采用形态学和生化鉴定方式，但是这种方法的可靠程度不高。测序技术出现后，技术人员可以利用更为可信的方式鉴定菌株。例如，当16S rRNA的DNA序列被鉴定为具有97％(含)以上相似性时，判定两个菌属于相同的种。就红色诺卡氏菌而言，将保藏在国际(或国家级)菌种保藏单位中的已知菌株作为模式菌株，并与其进行比对。
[0015]本公开中，“红色诺卡氏菌细胞壁”既可以理解为完整的细胞壁，也可以理解为不完整的细胞壁(例如，破碎的、或部分降解的)。在本公开的教导下，技术人员将理解，显示出所需活性的成分来自红色诺卡氏菌的细胞壁(例如，是细胞壁本身或其组成成分)。因此，在临床应用中允许采用完整的细胞壁、经破碎的细胞壁、细胞壁的不完全降解产物、细胞壁的组成成分、细胞壁的提取物等各种形式，这些都包含在本公开范畴之内。
[0016]本公开的细胞壁骨架不能理解为仅仅表示细胞壁当中的交联网状实体，技术人员应理解该术语不排除交联网状实体上所吸附、结合、携带的其他细胞壁成分。
[0017]在具体的示例中，本公开的细胞壁骨架是细菌经破碎、除杂(蛋白、核酸、细胞膜、脂质)后所得的产物。
[0018]在具体的实施方案中，细胞壁骨架是国药准字S20030009或其更新编号对应的红色诺卡氏菌细胞壁骨架。
[0019]技术人员应当理解，S20030009是药监管理部门发放的行政许可编号，此号码会随着证件的更新、法律、编号规则的调整而变化。然而，号码变化后所代表的产品标准、产品参数、生产工艺、质量要求是不变的。因此，本公开中S20030009应理解为S20030009及其等同编号。
[0020]第二方面，本公开提供了一种间充质干细胞的外泌体的制备方法，包括步骤：
[0021]1)提供间充质干细胞；
[0022]2)用包含红色诺卡氏菌细胞壁骨架的培养介质孵育所述间充质干细胞；
[0023]3)收集细胞培养物中的上清液；
[0024]4)对上清液进行超高速离心；
[0025]5)收集外泌体。
[0026]在一些实施方案中，所述培养介质是无血清MSC培养介质。
[0027]在一些具体的实施方案中，培养介质包含适用于培养间充质干细胞的本领域公知的其他成分。当应用于人时，为了提供更安全的细胞，在培养过程中建议不含异源动物成分；例如无血清培养介质。
[0028]在一些具体的实施方案中，技术人员可以根据需要(比如，维持干性，或促进分化)向细胞培养介质加入细胞因子，例如FGF、PDGF、TGF
‑
β、HGF、EGF、CTGF、VEGF、胰岛素、胰岛素样生长因子中的一种或组合。
[0029]在一些具体的实施方案中，FGF的含量(以终浓度计)优选为0.1至100ng/ml。FGF是指成纤维细胞生长因子家族中的生长因子，优选为FGF
‑
1、bFGF。
[0030]在一些具体的实施方案中，PDGF的含量(以终浓度计)优选为0.5至100ng/ml。PDGF是指血小板衍生生长因子家族中的生长因子，优选为PDGF
‑
BB或PDGF
‑
AB。
[0031]在一些具体的实施方案中，TGF
‑
β的含量(以终浓度计)优选为0.5至100ng/ml。
TGF
‑
β是指转化生长因子
‑
β家族中的生长因子，优选为TGF
‑
β3。
[0032]在一些具体的实施方案中，HGF的含量(以终浓度计)优选为0.1至50ng/ml。
[0033]在一些具体的实施方案中，EGF的含量(以终浓度计)优选为0.5至200ng/ml。
[0034]在一些具体的实施方案中，培养介质还包含至少一种磷脂、和/或至少一种脂肪酸。
[0035]磷脂可列举，例如：磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的外泌体，其中：所述间充质干细胞是经红色诺卡氏菌细胞壁骨架培养的间充质干细胞；所述间充质干细胞选自以下的任一项：脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、肝脏间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、牙髓间充质干细胞；优选地，所述红色诺卡氏菌细胞壁骨架是国药准字S20030009或其更新编号对应的红色诺卡氏菌细胞壁骨架。2.间充质干细胞的外泌体在制备药物中的用途，其中：所述药物用于皮瓣移植术；所述间充质干细胞是经红色诺卡氏菌细胞壁骨架培养的间充质干细胞。3.根据权利要求2所述的用途，其中所述间充质干细胞选自以下的任一项：脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞、肝脏间充质干细胞、肌肉间充质干细胞、肺间充质干细胞、胰腺间充质干细胞、牙髓间充质干细胞。4.根据权利要求2或3所述的用途，所述药物制备成选自以下任一项的剂型：注射剂、膏剂、霜剂、乳液、混悬剂、糊剂、凝胶剂、洗剂、片剂、气雾剂、喷雾剂、搽剂、粉剂、敷料、绷带、膜、贴片、栓剂。5.根据权利要求2至4中任一项所述的用途，所述药物能够实现选自以下任一项：增强移植皮瓣的血管生成、提高移植皮瓣的成活率、改善移植皮瓣的外观。6.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中所述红色诺卡氏菌细胞壁骨架是国药准字S20030009或其更新编号对应的红色诺卡氏菌细胞壁骨架。7.根据权利要求2至5中任一项所述的用途，其中所述红色诺卡氏菌细胞壁骨架通过以下方法获得，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：1)提供红色诺卡氏菌；2)破碎所述红色诺卡氏菌，得到破碎产物；3.1)对所述破碎产物去除脂质；3.2)对所述破碎产物去除核酸；3.3)对所述破碎产物去除蛋白质；3.4)对所述破碎产物去除细胞膜；3.5)得到红色诺卡氏菌细胞壁骨架；4)任选地，分装；5)任选地，对所述红色诺卡氏菌细胞壁骨架进行冷冻干燥；其中，步骤3.1)、3.2)、3.3)、3.4)能够互换或并行，步骤4)和步骤5)能够互换；所述破碎的平均粒度为10nm至1000nm，优选10nm至800nm，更优选10nm至500nm。8.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其中所述间充质干细胞是通过以下方法培养的，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
1)提供间充质干细胞；2)用包含红色诺卡氏菌细胞壁骨架的培养介质孵育所述间充质干细胞；优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：金培生，盖波，张轶，李强，张爱君，
申请(专利权)人：辽宁天安生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：