本发明专利技术涉及一种检测马立克氏病病毒血清3型毒株的荧光定量PCR试剂盒及其在禽用生物制品质量控制中的应用。所述试剂盒含有用于检测马立克氏病病毒血清3型毒株一对特异性引物和相应的Taqman探针。本发明专利技术特异性好，马立克氏病病毒血清3型毒株扩增曲线良好，禽用病毒类生物制品及生产原材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，用本发明专利技术建立的方法检测不同PFU的Fc126毒株，检出限度为0.06PFU；检测10倍梯度稀释的标准品质粒，检出限度为10copies/μL；可用于禽用生物制品中外源性马立克氏病病毒的检测，对于马立克氏病病毒的检测、禽用生物制品质量控制等具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种马立克氏病病毒(Marker’sdiseasevirus,MDV)血清3型荧光定量PCR试剂盒及其在生物制品质量控制中的应用，属于生物技术和动物病毒学领域。
技术介绍
马立克氏病(Marker’sdisease,MD)是鸡的一种急性或亚急性淋巴细胞增生性疾病，主要表现为外周神经、皮肤、虹膜及其他组织器官出现单核细胞浸润。该病的病原马立克氏病病毒(Marker’sdiseasevirus,MDV)属于α疱疹病毒亚类的Mardivirus属，根据病毒的血清学反应，分为3个血清型，即MDV血清1型(禽疱疹病毒2型)、MDV血清2型(禽疱疹病毒3型)和MDV血清3型(火鸡疱疹病毒1型)。与其它疱疹病毒相比，禽疱疹病毒最显著的特性是细胞结合性，即在细胞培养上不产生游离于细胞培养液中有感染性的病毒粒子(特别是MDV血清1型毒株)。基于MDV的生物学特性，现有外源性MDV检验方法主要是通过鸡胚法观察尿囊膜病变、细胞法检查细胞病变、鸡检查法通过琼脂扩散实验测定抗体。但随着兽用生物制品品种的不断增加和生物技术的不断进步，现有的外源性MDV检验国家标准已不能完全满足检验、检测的需求。主要表现在两个方面：一是方法敏感性问题，如鸡检查法中MDV采用琼脂扩散实验进行抗体检测，敏感性低、稳定性差、检测时间长、不同来源检测抗原反应性差异较大；二是方法的鉴别性不强，如不同血清型马立克氏病病毒相互污染时，无法进行外源性马立克氏病病毒的鉴别。荧光定量PCR已作为一种快速、灵敏的诊断方法被广泛使用，特别是在取代传统方法不易或不能检测的病原的检测方面具有重要意义。2019年，在非洲猪瘟肆虐的形势下，对于不易分离鉴定的非洲猪瘟病毒，我国农业农村部及时制定了猪用生物制品及猪源原辅材料中污染非洲猪瘟病毒的PCR和荧光定量PCR检测方法，为严把兽用生物制品质量关，做好非洲猪瘟防控提供了坚实的技术保障。而目前禽用生物制品中，外源性MDV检测国家标准中并无分子生物学相关的检测技术，因此，我们选择编码MDV核衣壳蛋白UL19的基因为靶标，建立MDV血清3型毒株荧光定量PCR检测方法，用于禽用生物制品外源性马立克氏病病毒污染的质量控制。
技术实现思路
本专利技术为克服现有外源性马立克氏病病毒检测方法敏感性低、鉴别性不强、检测时间长等的缺点，提供了一种特异、敏感、快速、可定量检测外源性马立克氏病病毒血清3型毒株的荧光定量PCR试剂盒，应用于禽用生物制品质量控制。为实现上述目标，本专利技术实施了以下技术方案：1.一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含两条特异性引物和相应的Taqman探针，qPCRBuffer(2×)、酶、标准品质粒、阳性提取对照品、阴性提取对照品、无酶水；所述的特异性引物和相应的Taqman探针，其序列分别为：序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactgtcgccttcta-3′20序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggctgtggtcatgg-3′20序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagcgacgtcgtcca-BHQ1-3′21；所述标准品质粒为所述引物从Fc126毒株血清3型马立克氏病病毒上扩增目的片段连接到pEASY-Blunt载体得到的；所述阳性提取对照品为10PFU灭活的血清3型Fc126毒株马立克氏病病毒；所述阴性提取对照品为SPF鸡胚尿囊液。2.本专利技术所述的试剂盒，其特征在于荧光定量PCR反应体系为20.0μL，包含：10.0μLqPCRBuffer(2×)、0.4μL酶、0.4μL上游引物、0.4μL下游引物、0.2μL探针、3.0μL模板和5.6μL无酶水；荧光定量PCR反应条件为95℃预变性2min；95℃变性3sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，扩增40个循环，收集荧光信号。3.本专利技术所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测马立克氏病病毒血清3型毒株时，按照以下步骤进行：(1)提取待检样品、阳性提取对照品及阴性提取对照品的总DNA；(2)将标准品质粒做1×107copies/μL到1×10-1copies/μL10倍系列稀释后作为模板，以权利要求1、6、7所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR，建立标准曲线；(3)以步骤(1)提取的总DNA为模板，以所述的特异性引物、探针、反应体系和条件进行荧光定量PCR；(4)根据标准曲线对待检样品中的病毒拷贝数进行定量；(5)若用于定性检测，则无需构建标准曲线。本专利技术的积极意义本专利技术涉及一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR检测方法及其在禽用生物制品质量控制中的应用。本专利技术特异性好，马立克氏病病毒血清3型毒株扩增曲线良好，禽类病毒生物制品及生产原材料未出现特异性扩增曲线；敏感性高，用本专利技术建立的方法检测不同PFU的Fc126毒株，检出限度为0.06PFU；检测10倍梯度稀释的标准品质粒，检出限度为10copies/μL；解决了现有外源性MDV检验方法敏感性低、检测时间长、鉴别性不强的问题，可用于禽用生物制品中外源性马立克氏病病毒的检测，对于马立克氏病病毒的检测、禽用生物制品质量控制等具有重要意义。附图说明图1为MDV血清3型荧光定量PCR检测方法敏感性检测及标准曲线的建立；图1A图中：1、2、3、4、5、6、7、8、9分别代表1×107copies/μL到1×10-1copies/μL10倍系列稀释标准品质粒的扩增曲线；图1B为标准曲线绘制结果：扩增效率E＝95.0％，R2＝0.998，标准曲线方程Y＝-3.447X+36.496。图2MDV血清3型荧光定量PCR检测方法特异性检测图中：1代表Fc126毒株的扩增曲线；2代表其他禽用病毒类生物制品、毒种及生产原材料的扩增曲线；图3MDV血清3型荧光定量PCR检测方法敏感性检测图中：1、2、3、4、5、6、7、8分别代表600、60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006、0.00006PFUFc126毒株的扩增曲线；图4MDV血清3型荧光定量PCR试剂盒应用于鸡新城疫活疫苗(Clone30株)污染不同PFUMDV血清3型Fc126毒株的检测图中：1、2、3、4、5、6分别代表100羽份NDV中混合60、6、0.6、0.06、0.006、0.0006PFUFc126毒株的扩增曲线；具体实施方式下面通过具体实施方式对本专利技术作进一步的说明，以更好的理解本专利技术，但其不构成对本专利技术的限制。实施例1——MDV血清3型荧光定量PCR检测方法的建立与条件优化1.针对UL19基因保守区域特异性引物和探针的设计从GenBank上下载收录的所有MDV血清3型本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含两条特异性引物和相应的Taqman探针，qPCR Buffer(2×)、酶、标准品质粒、阳性提取对照品、阴性提取对照品、无酶水；/n所述的特异性引物和相应的Taqman探针，其序列分别为：/n序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactg tcgccttcta-3′20/n序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggct gtggtcatgg-3′20/n序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagc gacgtcgtcca-BHQ1-3′21；/n所述标准品质粒为所述引物从Fc126毒株血清3型马立克氏病病毒上扩增目的片段连接到pEASY-Blunt载体得到的；/n所述阳性提取对照品为10PFU灭活的血清3型Fc126毒株马立克氏病病毒；/n所述阴性提取对照品为SPF鸡胚尿囊液。/n
【技术特征摘要】
1.一种马立克氏病病毒血清3型荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含两条特异性引物和相应的Taqman探针，qPCRBuffer(2×)、酶、标准品质粒、阳性提取对照品、阴性提取对照品、无酶水；
所述的特异性引物和相应的Taqman探针，其序列分别为：
序列1上游引物(Fc126-UL19-F)：5′-gcgatcactgtcgccttcta-3′20
序列2下游引物(Fc126-UL19-R)：5′-agtaacggctgtggtcatgg-3′20
序列3Taqman探针(Fc126-UL19-P)：5′-FAM-tgtaacgagcgacgtcgtcca-BHQ1-3′21；
所述标准品质粒为所述引物从Fc126毒株血清3型马立克氏病病毒上扩增目的片段连接到pEASY-Blunt载体得到的；
所述阳性提取对照品为10PFU灭活的血清3型Fc126毒株马立克氏病病毒；
所述阴性提取对照品为SPF鸡胚尿囊液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于荧光定量P...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏佳，陈晓春，赵炜，王嘉，侯力丹，刘丹，曹明慧，薛青红，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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