一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒，其包括CRISPR‑Cas检测体系：如本发明专利技术所述的crRNA、Cas蛋白和核酸探针。本发明专利技术还提供了一种呼吸道病原的核酸的检测方法、一种分离的核酸、crRNA、引物对及其应用。本发明专利技术的试剂盒和检测方法不依赖于大型仪器而可通过肉眼直接进行结果观测，在温和的条件即可实现检测，检测更方便；使用本发明专利技术的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒等)，特异性和灵敏度均较高，可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感、乙型流感以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。

【技术实现步骤摘要】
一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、检测方法及应用。
技术介绍
COVID-19案例很快出现在世界各国，并被世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)宣布为世界性的公共卫生威胁。虽然目前报道COVID-19的中位发作时间为4-5天，但有一小部分感染者是在14天隔离之后才出现症状。COVID-19最常见的症状是咳嗽和发烧。不过，也有一定比例的病人并不呈现症状，包括X光检测及CT检测。COVID-19出现症状时间的不确定以及无症状感染的情况给疾病的早期精准检测带来了极大障碍，因而也使得疾病防控极具挑战。这使得COVID-19病原核酸的分子检测变得尤为重要。引起COVID-19的病原已经被确认为是β属冠状病毒，被命名为SARS-CoV-2。和其他冠状病毒类似，SARS-CoV-2是单链、正义的RNA病毒。SARS-CoV-2和SARS-CoV以及中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)分别具有79％和50％的核酸相似性。针对COVID-19的现有分子诊断方法主要是基于反转录PCR(RT-PCR)。SARS-CoV-2的E、N以及ORF1ab基因是常用的RT-PCR的靶标基因。高通量的RT-PCR平台也已被研发出来用于大规模的诊断。不过，RT-PCR通常依赖于特别的、大型的仪器，因此大规模的RT-PCR检测往往局限于在医院的病人。最近研究表明，ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicrRepeats(CRISPR)技术可用于病原的低成本、便携式的分子检测。CRISPR以及CRISPR-associatedgenes(Cas)基因是细菌抵御外源病毒感染的免疫系统。CRISPR的模块特性使得此技术被广泛应用于基因组工程中。基于CRISPR的病原核酸的分子诊断依赖于Cas核酸酶的RNA或DNA的靶向活性。同时，不同CRISPR系统可以组合实现对病原的多重检测。在最近中国爆发的非洲猪瘟疫情中，很多基于CRISPR-Cas12a的诊断平台被开发出来。目前作为新发传染病的新型冠状病毒，其亚基因组表达谱尚未被清晰阐明，各个基因的表达情况以及各个基因片段对扩增及CRISPR-Cas检测的敏感性也不清楚，能否设计出针对新型冠状病毒(简称新冠)、甲型流感病毒(简称甲流)以及乙型流感病毒(简称乙流)等呼吸道病原的且特异性高、无交叉反应的检测方法等本身目前仍然是未被阐明的科学问题。目前检测新型冠状病毒时所使用的传统RT-qPCR方法较容易误检，且不太容易区分新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的区别，这三种在临床表现上的症状是十分相似的，而实际应用时也发生了将新冠误诊为流感的案例(Kongetal.,2020,NatMicrobiol)。此外，基于CRISPR-Cas12a的病原检测技术已有报道(Gootenbergetal,2017,Science；Gootenbergetal,2018,Science；Chenetal,2017,Science；)，特别是针对新型冠状病毒的CRISPR检测平台也已研发成功(Wangetal,2020,SciBull；Guoetal,2020,CellDiscov；Broughtonetal,2020,NatBiotech)，不过这些研究多侧重原理性的技术研发，对技术实现病原特异性检测的研究不够深入，如没有对各个病原亚型间特异性进行研究，同时并未明确不同探针组合间的交叉反应(如病原A探针和病原B探针在两种病原间是否存在交叉反应)。因此，急需一种既高效快速、又具有较高的特异性和灵敏度、且检测多种呼吸道病原时无交叉反应的引物及crRNA探针，以实现对多种呼吸道病原的特异性检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有检测呼吸道病原(例如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、甲型流感、乙型流感)的方法依赖于大型仪器、检测不方便等缺陷，提供了一种检测呼吸道病原的核酸的试剂盒、一种呼吸道病原的核酸的检测方法、一种分离的核酸、crRNA、引物对及其应用。首先，本专利技术的试剂盒和检测方法不依赖于大型仪器而可通过肉眼直接进行结果观测，同时在温和的条件(25-42℃)即可实现检测，检测更方便。使用本专利技术的试剂盒和检测方法可用于高效、快速地检测/诊断呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等)。其次，使用本专利技术的试剂盒和检测方法检测多种呼吸道病原(例如甲型流感、乙型流感以及新冠状病毒等)相互之间时无交叉反应，且检测的特异性和灵敏度均较高。目前没有任何专利或文献报道能够完整的实现新型冠状病毒、甲型流感、乙型流感的同时检测，本申请首次提供了一种试剂盒和检测方法等，其在保证灵敏度的同时，实现对新冠、甲流和乙流的完整的、交互的特异性检测。本专利技术的试剂盒和检测方法可用于呼吸道病原的检测与筛查，例如快速区分包括甲型流感(包括各种亚型)、乙型流感(包括各种亚型)以及新型冠状病毒在内的多种呼吸道病原。此外，目前所有基于CRISPR的检测都是采用呼吸道样品如咽拭子或鼻拭子，而本专利技术的试剂盒和检测方法进一步还可以实现对除呼吸道样品外其他类型样品(例如肛拭子、粪便、痰液、痰液上清等分泌物)的检测；同时可对活体组织来源的、含有多种病原的样品中各个病原实现检测。首先，在设计检测新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒的crRNA和引物时，一方面需要考虑检测新冠和其他流感时预防出现交叉反应而出现误诊，另一方面由于新冠病毒自身的亚基因组结构(subgenomicarchitecture)并未有明确的科学阐释。目前研究表明，新冠病毒的亚基因组结构由于含有10个不连续的编码区而十分复杂，各个基因的表达情况以及各个基因片段对扩增及CRISPR-Cas检测的敏感性也不清楚；同时除了已知的10个编码区还有其他未知的转录本。在设计引物时需要寻找出转录效率高的病原基因片段进行设计(例如本专利技术人发现，同为新冠病毒基因，N基因比M基因更易获得高效扩增的引物(图14和15)；还发现同为M基因，不同片段的扩增效率差异很大(图14))、设计crRNA时需要满足Cas12aPAM序列的限制，同时还需要考虑必须定位于引物扩增区域之内，同时满足这些要求的引物对和crRNA还需要能够保证较高的灵敏度和特异性，还需要保证同时检测新型冠状病毒和其他流感如甲型流感病毒和乙型流感病毒时不发生交叉反应，设计难度非常大。其次，特异性反映的是筛检试验确定非阳性样本的能力；灵敏度是指某方法对单位浓度或单位量待测物质变化所致的响应量变化程度；在设计crRNA和引物对的过程中，需要平衡特异性和灵敏度的关系，众所周知本领域中同时提高敏感度和特异度的难度非常大。在保证高特异性的同时灵敏度就会有所下降，在保证灵敏度高的同时特异性就会下降。本专利技术所要保护的试剂盒中检测不同的病毒时，不仅能够保证特异性的同时，而且还能够保证很高的灵敏度。此外，目前所有的基于CRISPR的检测都是采用咽拭子等呼吸道本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种crRNA，其特征在于，所述crRNA为检测呼吸道病原的核酸的crRNA，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中；/n检测所述新型冠状病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:29-40、42、43、45-48中的一种或多种所示；/n检测所述甲型流感病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:50-52中的一种或多种所示；/n检测所述乙型流感病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO:53-56中的一种或多种所示；/n所述crRNA优选用于CRISPR-Cas检测体系。/n

【技术特征摘要】
1.一种crRNA，其特征在于，所述crRNA为检测呼吸道病原的核酸的crRNA，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中；
检测所述新型冠状病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:29-40、42、43、45-48中的一种或多种所示；
检测所述甲型流感病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:50-52中的一种或多种所示；
检测所述乙型流感病毒的crRNA的序列如SEQIDNO:53-56中的一种或多种所示；
所述crRNA优选用于CRISPR-Cas检测体系。


2.一种扩增呼吸道病原的核酸的引物对，所述呼吸道病原为新型冠状病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒；其中，
扩增所述新型冠状病毒的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:58-97中的一种或多种所示；
扩增所述甲型流感病毒的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:98和SEQIDNO.99所示；
扩增所述乙型流感病毒的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:100和SEQIDNO.101所示；
所述引物对优选用于QPCR、LAMP或RPA中以扩增所述核酸。


3.一种用于检测呼吸道病原的核酸的试剂盒，其特征在于，其包括CRISPR-Cas检测体系，所述CRISPR-Cas检测体系包括：crRNA、Cas蛋白和核酸探针；其中，所述crRNA如权利要求1所述；
较佳地：
所述试剂盒还包括扩增所述核酸的引物对；其中，扩增新型冠状病毒的引物对的核苷酸序列优选如SEQIDNO:58-97中的一种或多种所示；和/或，扩增甲型流感病毒的引物对的核苷酸序列优选如SEQIDNO:98和SEQIDNO.99所示；和/或，扩增乙型流感病毒的引物对的核苷酸序列优选如SEQIDNO:100和SEQIDNO.101所示，所述的引物对优选用于QPCR、LAMP或RPA中以扩增所述核酸；
和/或，所述CRISPR-Cas检测体系还包括金属离子和/或缓冲液；
和/或，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas12b和/或Cas13；
和/或，所述Cas蛋白的含量为100ng；
和/或，所述试剂盒的检测样品为痰液、痰液上清、鼻拭子、咽拭子、肛拭子和/或粪便。


4.一种用于检测呼吸道病原的核酸的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求2所述的扩增呼吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海;31