从多肽全能文库恢复可逆可解折叠多肽的方法技术

本发明专利技术涉及可逆可解折叠多肽（如，受热时解折叠，冷却时重折叠），涉及包含可逆可解折叠多肽的全能文库，并涉及含可逆可解折叠多肽或编码可逆可解折叠多肽核酸的文库。本发明专利技术还涉及制备富含可逆可解折叠多肽或编码可逆可解折叠多肽核酸文库的方法。本发明专利技术涉及选择和／或分离可逆可解折叠多肽的方法，涉及制备可逆可解折叠多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2004年3月17日提交的临时申请60/554,021的权益，要求2003年5月14日提交的临时申请60/470,340的权益。上述申请全部内容参考并入本文。本专利技术的背景多肽在多种应用中已变成越来越重要的试剂，包括作为医药治疗和诊断试剂的应用以及多种工业应用。限制多肽更多应用的一个因素是多肽的物理和化学性质。如，多肽必须保持适当的折叠状态才有活性。然而，在储存条件下或在应用条件下(受热或在有机溶剂中)，多肽有解折叠或变性的趋向。此外，在利用生物制备系统制备多肽时，很多多肽的产率很低。因此，很多多肽由于造价昂贵而不能生产。限制多肽更多应用的一个重要因素是解折叠的或变性多肽不可逆聚集的趋势。聚集受到多肽浓度的影响，并认为产生在多种情况中，如部分折叠或解折叠中间产物。有利于部分折叠的中间产物的因素或条件，如升高温度以及高多肽浓度会促使不可逆聚集。(Fink，A.L.，Folding & Design 3R23(1998).)如，以浓缩的形式储存提纯的多肽，如冻干制备品，常常导致至少部分多肽不可逆聚集。同样，在生物系统中表达制备多肽，如在E.Coli中，常常导致形成含有聚集多肽的包含体。从包含体中恢复活性多肽是非常困难的，需要在生物制备系统中加入其他步骤，如重折叠步骤。一种已尝试的制备具有改进特性的多肽的方法是选取具有改进稳定性活溶解性的多肽变体。(参看，如，Jung，S，et al.J.Mol.Biol.294163-180(1999)；Davies，J and Riechmannn.L.，Prot.Eng.9531-537(1996)；Waldo，G.S.Curr.Opin.Chem.Biol.733-38(2003))。然而，改进的稳定性或溶解性的选取不解决聚集的问题，因为稳定性(如热稳定性，热力学稳定性)和溶解性是适当折叠的多肽的特性，而聚集是从部分折叠或部分变性状态产生的。此外，多肽稳定性和聚集之间没有证实的相关性(Fink，A.L.，Folding & Design 3R23(1998).)。因此，存在一种使用生物制备系统高产率制备改进特性的多肽的需要。本专利技术的概述本专利技术涉及可逆可解折叠多肽，涉及包含可逆可解折叠多肽的全能文库，并涉及含可逆可解折叠多肽或编码可逆可解折叠多肽核酸的文库。本专利技术还涉及制备富含可逆可解折叠多肽或编码可逆可解折叠多肽核酸的文库的方法。本专利技术涉及选择和/或分离可逆可解折叠多肽的方法，涉及制备可逆可解折叠多肽的方法。一方面，本专利技术是从多肽文库或全能文库(如多肽展示系统)选择，分离和/或恢复可逆可解折叠的方法。在一个实施方案中，方法包括解折叠多肽群(如文库或全能文库或多肽展示系统中的多肽)，重折叠部分解折叠的多肽，选择，分离和/或恢复重折叠多肽。在另一个实施方案中，方法包括提供解折叠多肽群(如文库或全能文库或多肽展示系统中的多肽)，重折叠至少部分解折叠多肽，选择，分离和/或恢复重折叠多肽。在另一个实施方案中，方法包括提供多肽展示系统，其中多肽展示系统包括全能文库，加热全能文库到至少部分展示的多肽解折叠的温度(Ts)，冷却全能文库到低于Ts的温度(Tc)以制备冷却的全能文库。冷却的全能文库包括至少部分解折叠并重折叠的多肽以及部分聚集的多肽。方法进一步包括在温度(Tr)恢复至少一种结合配体并可逆可解折叠的多肽。优选地，配体结合折叠多肽，不结合聚集多肽，恢复的多肽具有融解温度(Tm)，Ts＞Tm＞Tc，Ts＞Tm＞Tr。另一方面，本专利技术涉及可逆可解折叠多肽的全能文库，涉及编码可逆可解折叠多肽的核酸的文库，涉及制备这样文库和全能文库的方法。一方面，本专利技术是分离的可逆可解折叠多肽。在一些实施方案中，可逆可解折叠多肽是氨基酸序列与亲代多肽不同(如一个或多个氨基酸替换，插入和/或缺失)但性质上保持亲代多肽功能的亲代多肽的变体。本专利技术还涉及制备富含可逆可解折叠可变域的抗体可变域文库的方法。在一个实施方案中，方法包括(1)提供噬菌体展示系统，其中噬菌体展示系统包括多种展示的抗体可变区域，其中至少部分展示的抗体可变区域已经解折叠并重折叠，(2)从所述噬菌体展示系统中选择展示解折叠，重折叠并恢复结合功能的可变区域的噬菌体，(3)获得编码展示在恢复噬菌体上的可变区域的CDRl和/或CDR2的核酸，以及(4)装配编码抗体可变域的核酸文库，其中在(3)中获得的所述核酸可操作连接一种或多种其他核酸以制备编码其中CDRl和/或CDR2由(3)中获得的核酸编码的抗体可变域的构建体文库。在具体实施方案中，基本上(1)中所有展示的可变区域已通过加热到约80C而解折叠，通过冷却而重折叠。在其他具体实施方案中，在(4)中装配的核酸文库编码抗体可变域，其中CDR3是随机化的，不是从已选择的能可逆可解折叠的抗体可变区域衍生的。本文所描述的可逆可解折叠多肽可在E.coli或酵母培养物的上清液中高产率地制备成可溶蛋白质。附图的简述附图说明图1演示了编码人类免疫球蛋白重链可变区域DP47dummy(本文中也称DP47d)的核酸，包括胚系VH基因片段DP47和胚系VJ基因片段JH47d(SEQ ID NO1，编码链，SEQ ID NO2，非编码链)。图1还演示了编码的VH域的氨基酸序列(SEQ IDNO3)。氨基酸是依据Kabat系统计数排列的。(Kabat，E.A.et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Service，U.S.GovernmentPrinting Office(1991))。图2演示了编码人类免疫球蛋白轻链(κ)可变区域DPK9dummy(本文中也称DPK9d)的核酸，包括胚系VK基因片段DPK9和胚系JK基因片段JKl(SEQ ID NO4，编码链，SEQID NO5，非编码链)。图2还演示了编码的VK域的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。氨基酸是依据Kabat系统计数排列的。图3A-3F是演示在热诱导解折叠和重折叠后在DP47d支架上展示VH域的噬菌体克隆保留的蛋白质A结合活性的相对量的直方图。每种噬菌体克隆的样品受热使展示的VH域解折叠，然后冷却重折叠，另一种样品保持不受热。热处理的以及没有热处理的噬菌体样品结合蛋白质A的活性由ELISA测定。热处理克隆体的结合活性表示为没有热处理克隆体的结合活性的百分比。标注dp47的条状表示DP47d。图4A-4C是演示图3A-3F中展示在噬菌体上几种VH域的保留相对于大于60％互补决定区(CDR1，CDR2，CDR3)氨基酸序列的表。这些序列在图4A-4C中克隆数是相同的。这些克隆体在本问文中用前缀“pA-”表示。如克隆体13也称为“pA-C13”。在图4A和4B中的第一组序列来自较高程度重折叠的克隆体，通过蛋白A的结合评定的(组1)。图4C中的下一组序列来自较好重折叠的克隆体。这些克隆体也包括CDR外的突变(组2)。图4C中的最后一组序列是来自较低程度重折叠的克隆体。图5演示了展示VH域进行可逆可解折叠的能力与VH域位置22到位置3本文档来自技高网...

【技术保护点】
从多肽全能文库中恢复至少一种可逆可解折叠多肽的方法，其中全能文库中可逆可解折叠的多肽具有区别折叠多肽和解折叠或错折叠多肽的共同可选择特性，方法包括：提供包括展示多肽的全能文库的多肽展示系统；解折叠至少部分所述展示多肽；　 　重折叠至少部分解折叠多肽；以及恢复至少一种可逆可解折叠并具有所述的可从重折叠部分选择的特性的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳伦特S杰斯珀斯，菲利普C琼斯，克瑞斯托弗HJ菲玛，格雷戈里P温特，
申请(专利权)人：多曼蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]