本发明专利技术涉及具有特定唾液酸化程度的高活性糖蛋白，一种含该糖蛋白的用于诊断或治疗的药用组合物，一种测定高活性糖蛋白及其生产条件的方法，一种生产高活性糖蛋白的方法和一种用于分泌性糖蛋白不同唾液酸化的方法。本发明专利技术还涉及将重组表达高活性糖蛋白用于生物学目的和预防和／或治疗或诊断疾病，尤其是骨髓移植、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、ＡＭＬ及骨髓增生异常综合征、癌症、ＨＩＶ和／或造血系统疾病。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有最佳唾液酸化程度的高活性糖蛋白，一种含该糖蛋白的用于诊断或治疗的药用组合物，一种测定高活性糖蛋白及其生产条件的方法，一种生产高活性糖蛋白的方法和一种用于分泌性糖蛋白不同唾液酸化的方法。本专利技术还涉及重组表达的高活性糖蛋白为生物学目的以及在预防和/或治疗或诊断疾病中的应用，所述疾病尤其是骨髓移植、中性粒细胞减少症、血细胞减少症、AML及骨髓增生异常综合征、癌症、HIV和/或造血系统疾病。糖蛋白是一组功能和产生大不相同的蛋白。在具有治疗潜能的蛋白质中，大多数蛋白质为糖基化蛋白，例如许多激素(如生长激素(Growth hormone)、胰高血糖素(Glycagon)、FSH及LH)、生长因子(如GM-CSF、G-CSF、VEGF及促红细胞生成素(Erythopoietin))、细胞因子(如IL-2、IL-7、干扰素-α及干扰素-β、TNF-α)、抗凝血剂(如重组水蛭素(Lepirudin)、地西卢定(Desirudin))、血液凝固因子(如因子VII、VIII及IX)、疫苗(如乙型肝炎抗原)及抗体。为生产此类蛋白质，已建立的细胞生产系统不能够生产具有原始的人糖基化作用的蛋白质。原核细胞(如细菌)及大多数真核细胞系统(如酵母、昆虫及植物细胞)合成无糖基化作用或携带与人糖链大不相同的聚糖的蛋白质。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是一种常用的生产系统，它能够以与人细胞相似的方式对蛋白糖基化，但与人细胞还有某些重要差异，例如，在半乳糖基化作用、岩藻糖基化、使用N-乙酰葡糖胺的特殊糖基化中，以及尤其在唾液酸化的各方面。在建立这些生产系统的时候，生产至少在某种程度上具有活性的治疗蛋白是足够的。目前，很大努力集中在以下述目的改进治疗蛋白的活性(i)减少治疗蛋白的使用剂量的数目和浓度，(ii)减少治疗费用，以及(iii)减轻副作用。其中一个策略是提高表达系统的生产力，然而，在大多数情况下，可导致不产生糖基化作用，或仅产生在大多数情况下与蛋白质无关的非常异常的糖基化作用。还会产生其它问题，例如稳定性降低及分子的折叠常导致在生产中需要其它步骤，这会浪费时间及成本并导致损失、副作用及生物活性欠佳。改进蛋白质生物活性的主要策略是延长其血清半衰期并因此延长其生物活性。这可通过被称为聚乙二醇化作用(PEGylation)的方法完成，其中某些形式的聚乙二醇被化学添加至所生产的蛋白质中。聚乙二醇(PEG)增加分子量并因此增加血清半衰期。然而，有几个问题与此方法有关，例如，在几乎所有情况下，聚乙二醇化作用通过其细胞效应子功能减小蛋白质的活性，作为中和抗体在人体中重复使用常导致不良免疫反应，和/或生产过程需要其它化学修饰，从而导致需要附加成本、损失及时间的多步骤过程。另外，为提高重组表达蛋白的血清半衰期，糖链的修饰是问题的焦点。因此，技术问题集中在使重组糖蛋白的唾液酸化程度最大化。唾液酸是真核细胞表面分布最广的末端单糖，通常认为糖蛋白被唾液酸化程度越大，它在循环中的血清半衰期就越长。这是基于某些受体的存在，例如肝脏中的无唾液酸蛋白质受体，该受体结合循环的非唾液酸化蛋白并指导它们进入细胞进行降解。已经提出了一些策略使重组糖蛋白的唾液酸化程度增加至最大可能的唾液酸化程度，包括(i)制备过量表达特定的唾液酸转移酶或半乳糖转移酶的重组宿主细胞系，其中这两种酶可为唾液酸化提供多数末端，(ii)通过调节糖水解酶(glycohydrolytic enzyme)防止宿主细胞唾液酸降解，如向培养基添加铜离子，(iii)在其它糖缀合物及其它底物存在下培养产生重组糖蛋白的宿主细胞，以增加寡聚糖的产生，(iv)变化培养条件，(v)使蛋白质发生突变，以引入其它糖链，并因此引入更多唾液酸，以及(vi)在糖蛋白生产后使用纯化的唾液酸转移酶完成活体外唾液酸化。所有这些技术具有一系列缺点，仅被设计用于通过使唾液酸化程度最大而增加血清半衰期。如前所述，现有技术具有一系列关键性缺点，仅提供用于改进生物活性、减轻副作用或毒性的一小部分糖基化潜能，因此不能够传递用于某些用途的糖蛋白。现有技术几乎不具有糖蛋白的生物活性是否与唾液酸化程度有关的知识，这是因为对于相应的重组糖蛋白来说没有合适的试验和生产系统。本专利技术通过下述方法提供高活性糖蛋白来解决这个问题，该方法包括以下步骤在添加有一定浓度的至少一种唾液酸前体添加物的培养基中，使用一种表达细胞系表达所述高活性糖蛋白，所述表达细胞系隐含唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷，并使用编码糖蛋白的核酸转染该表达细胞系，唾液酸前体添加物的浓度通过以下步骤确定(i)通过使用不同浓度的至少一种唾液酸前体进行不同唾液酸化，表达所述糖蛋白的多种不同唾液酸化形式；(ii)使用合适的生物测定方法测定不同唾液酸化形式的活性，与参考糖蛋白进行对比；(iii)筛选较高/最高活性的唾液酸化形式并测定与所述糖蛋白的较高/最高活性水平有关的唾液酸前体添加物的浓度。因此，本专利技术还涉及一种方法。根据本专利技术，术语“参考糖蛋白”是具有与本专利技术糖蛋白相同或相似蛋白序列的糖蛋白，优选地是具有相同蛋白序列的糖蛋白。也可能缺乏糖基化结构。参考糖蛋白具有确定的活性，可为天然来源或重组表达产生。优选的参考糖蛋白为已知的重组糖蛋白。在现有技术的特定蛋白序列发生突变，导致活性提高，例如体外受体介导的活性提高的情况下，本专利技术较高活性糖蛋白可在此方面和/或与其它生物活性相关方面例如免疫原性方面具有较高活性，而在前述活性方面不具有更高活性。在这些实例中，免疫原性的较高活性可有利于用于哺乳动物，优选地为人，因此在本专利技术意义上等于较高活性的糖蛋白。本领域普通技术人员能够选择临床前和/或临床试验方案有关的合适选择标准。根据本专利技术，术语“表达细胞系”是指可用于蛋白质、糖蛋白、病毒或其它生物材料表达的一种细胞或细胞系，可以进一步使用或不使用本领域普通技术人员已知或本专利技术其它部分描述的技术重组表达目的基因，或病毒感染，或本领域普通技术人员已知的适宜材料获得。根据本专利技术，术语“隐含唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷的表达细胞系”是指CMP-唾液酸合成有关的酶缺陷的表达细胞系。缺陷是指相应的酶活性减小或完全丧失，并可归因于不同的基本缺陷例如与其功能相关的酶基因水平、基因表达、酶活性或酶的生物利用度方面。酶例如，UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶、激酶(如N-乙酰甘露糖胺激酶、N-乙酰葡萄糖胺激酶)、N-乙酰神经氨酸-9-P(Neu5Ac-9-P)合成酶、Neu5Ac-9-P-磷酸酯酶以及CMP-Neu5Ac合成酶。在唾液酸的糖核苷酸生物合成途径中，更优选的缺陷是差向异构酶的突变，甚至更为优选的是导致无mRNA表达的UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶的缺陷。缺陷导致在标准条件下和/或无血清条件下细胞的唾液酸化减少或几乎完全或完全丧失。此减少的唾液酸化可通过添加唾液酸前体添加物部分或完全重建。该缺陷不限于CMP-唾液酸合成有关的一种或多种酶缺陷，也可存在于其它酶，只要通过添加唾液酸前体添加物部分或完全重建该结果。本专利技术的一个实例(但不仅这一个)是作为CMP-唾液酸运载体相应的糖转运酶。本领域普通技术人员能够确定本专利技术哪种单个缺陷或多个缺陷的组合是合适的，其中某些缺陷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高活性糖蛋白，由包括以下步骤的方法生产： 在添加有一定浓度的至少一种唾液酸前体添加物的培养基中，使用一种表达细胞系表达所述高活性糖蛋白，所述表达细胞系隐含唾液酸的糖核苷酸生物合成途径的至少一种缺陷，并使用编码该糖蛋白的核酸转染该表达细胞系，唾液酸前体添加物的浓度通过以下步骤确定： （ｉ）通过使用不同浓度的至少一种唾液酸前体进行不同唾液酸化，表达所述糖蛋白的多种不同唾液酸化形式； （ｉｉ）使用合适的生物测定方法测定不同唾液酸化形式活性，与参考糖蛋白进行对比； （ｉｉｉ）筛选较高／最高活性的唾液酸化形式，并测定与所述糖蛋白的较高／最高活性水平有关的唾液酸前体添加物的浓度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S戈莱兹，H鲍迈斯特，U舍贝尔，
申请(专利权)人：格莱克托普有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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