一种呈递并激活HSV-1型溶瘤病毒的CAR-T技术及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有杀伤实体肿瘤细胞的系统，包含HSV‑1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和scFv‑synNotch‑Cre元件；其中scFv为靶向肿瘤特异性抗原的单链抗体，Notch为Notch跨膜和剪切位点核心元件，Cre为基于Loxp位点的重组酶；本发明专利技术所述系统通过CAR‑T细胞精确呈递并激活HSV‑1型溶瘤病毒复制，起到联合治疗实体肿瘤的作用，无任何毒副作用，且效果卓越。

【技术实现步骤摘要】
一种呈递并激活HSV-1型溶瘤病毒的CAR-T技术及其应用
本专利技术涉及一种CAR-T细胞与溶瘤病毒联合的技术及其应用，具体是指一种基于synNotch-Cre系统的CAR-T细胞特异性呈递并精确激活具有开关的HSV-1型溶瘤病毒的技术和应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-TImmunotherapy)疗法是一种新兴的过继性免疫疗法，是继手术和化疗以外又一恶性肿瘤治疗的新策略，在B细胞急性白血病治疗方面以高达90％的完全缓解率获得大众的认可。2017年美国FDA相继批准两款CAR-T免疫治疗产品Kymriah(tisagenlecleucel，CTL-019)和Yescarta(axicabtageneciloleucel，KTE-C10)上市，分别应用于治疗用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病和难治、复发型成人大B细胞淋巴瘤患者。CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗方面取得了良好的疗效，但在实体肿瘤治疗中却有明显的短板，主要由于实体肿瘤有致密的肿瘤组织和更为复杂的肿瘤微环境，使CAR-T细胞难以从血液中浸润至肿瘤病灶，实体肿瘤细胞自身常表达PD-L1抗原以及微环境中常存在调节型T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)等使少量CAR-T浸润入后难以存活增殖和实行杀伤肿瘤细胞的能力。令人兴奋的是溶瘤病毒疗法刚好是针对实体肿瘤治疗而新兴的免疫疗法并可以较完美地补足CAR-T细胞在实体肿瘤治疗中的缺陷。2015年10月美国FDA批准首个溶瘤病毒产品talimogenelaherparepvec(T-vec,Imlygic)用于复发或不可切除病灶的黑色素瘤治疗。溶瘤病毒是一种经过基因编辑后可特异性在增殖通路被过度活化的肿瘤细胞内部复制和裂解而在正常组织和细胞中复制受抑制的病毒，由于溶瘤病毒特异性裂解肿瘤细胞的能力和临近细胞传播的特性，使溶瘤病毒在实体肿瘤治疗中独具优势，可以有效地裂解肿瘤细胞，破坏肿瘤微环境并在裂解肿瘤细胞的同时释放肿瘤相关抗原激活体内免疫反应，与CAR-T疗法形成较完美的互补杀伤实体肿瘤的作用。但溶瘤病毒大多采用瘤内给药的方式给药，当病灶比较隐匿如在颅骨内部或器官内部时瘤内给药较难实施，而静脉给药易被机体的抗肿瘤免疫反应消灭和在肝脏部位积聚不能达到理想的抗肿瘤效果，因此开发溶瘤病毒给药方案以及和CAR-T联合应用方案仍然是急需解决的肿瘤治疗难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，为解决上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种具有杀伤实体肿瘤细胞的系统及其制备方法和应用，该系统通过CAR-T细胞精确呈递并激活HSV-1型溶瘤病毒复制，起到联合治疗实体肿瘤的作用，且效果卓越。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。本专利技术提供了一种具有杀伤实体肿瘤的系统，所述系统包含HSV-1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体(CAR)和scFv-synNotch-Cre元件。较佳的，所述HSV-1型溶瘤病毒可源于HSV-1多种毒株改造而成，优选以下毒株中的一种或多种：HSV-1JS1、HSV-1F、HSV-117、HSV-1E19、HSV-1KOS、HSV-1v23、HSV-1v29以及其它临床野生毒株如HSV1-2006-50683、HSV1-2009-20371、HSV1-2011-3153等；更优选为HSV-117。进一步的，基于HSV-117毒株，通过同源重组的方式删除双拷贝的ICP34.5和单拷贝的ICP47，并在ICP34.5基因组位点插入CMV-EGFP-polyA标签基因表达框即得到可特异性在肿瘤细胞中复制的溶瘤病毒oHSV-1-X。更进一步的，在oHSV-1-X基础上利用同源重组的手段在ICP4翻译起始密码子ATG上游插入CMV-Loxp-Stop-Loxp元件调控ICP4基因的转录，得到具有开关的且当开关打开时才能复制的溶瘤病毒Switch-oHSV-1-X。所述Stop元件可由基因的CDS区和转录终止信号顺次连接而成；优选地，所述基因CDS区为荧光蛋白基因，更优选地，所述荧光蛋白基因为mCherry，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；优选地，所述转录终止信号为SV40PolyA信号，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，优选地，所示Loxp核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。CMV-Loxp-Stop-Loxp元件具体为CMV-Loxp-mCherry-polyA-Loxp，从5’端至3’端依次拼接CMV启动子、正向Loxp、mCherryCDS、SV40polyA、正向Loxp。较佳的，所述scFv-synNotch-Cre元件由从N段到C端顺次拼接信号肽、单链抗体(scFv)、Flag、Notchcore、Cre重组酶，所述单链抗体scFv可特异性识别实体肿瘤表面的特异性蛋白，其可与CAR中scFv相同或不同。优选地，所述信号肽为CD8α信号肽，更优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述Flag氨基酸序列如SEQIDNO.31；所述NotchCore元件为Notch跨膜和剪切位点核心元件，更优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Cre重组酶为可特异性识别Loxp位点并可以执行DNA重组功能的酶，更优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。所述scFv-synNotch-Cre元件与CAR通过P2A肽连接；优选地，所述P2A肽氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。较佳的，所述嵌合型抗原受体(CAR)从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体scFv、StreptagⅡ、CD8hinge、CD28TM+ICD、4-1BB、CD3ζ。优选所述信号肽为CD8α信号肽，更优选地，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述单链抗体scFv可特异性识别实体肿瘤表面的特异性蛋白；优选地，所述StreptagⅡ氨基酸序列如SEQIDNO.30所示；优选地，所述CD8hinge氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述CD28TM+ICD氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；优选地，所述4-1BB氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；优选地，所述CD3ζ氨基酸序列如SEQIDNO.7所示。较佳的，所述单链抗体scFv可靶向实体肿瘤靶点，如EGFRvIII、HER2、MUC1、GD2、IL13aII和/或PSCA等，优选为，EGFRvIII和/或HER2。scFv由重链可变区VH、连接多肽Linker、轻链可变区VL组成；优选地，所述EGFRvIII-scFv重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，所述EGFRvIII-scFv轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示；优选地，所述HER2-scFv重链可变区VH的氨基酸序列如SEQIDNO.13所示，所述HER2-scFv轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示；优选地，所述多肽链Linker氨基酸序列如SEQIDNO.15所示。本专利技术还提供了一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有杀伤实体肿瘤细胞的系统，其特征在于包含HSV-1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和scFv-synNotch-Cre元件；其中scFv为靶向肿瘤特异性抗原的单链抗体，Notch为Notch跨膜和剪切位点核心元件，Cre为基于Loxp位点的重组酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有杀伤实体肿瘤细胞的系统，其特征在于包含HSV-1型溶瘤病毒、嵌合型抗原受体和scFv-synNotch-Cre元件；其中scFv为靶向肿瘤特异性抗原的单链抗体，Notch为Notch跨膜和剪切位点核心元件，Cre为基于Loxp位点的重组酶。


2.如权利要求1所述的系统，其中，所述HSV-1型溶瘤病毒缺失ICP34.5基因和ICP47基因，且ICP4基因前同源重组插入CMV启动子和Loxp-Stop-Loxp序列。


3.如权利要求2所述的系统，其中，所述Stop由基因的CDS区和转录终止信号顺次连接而成；所述基因CDS区为荧光蛋白基因，所述转录终止信号的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，所述Loxp的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。


4.如权利要求3所述的系统，其中，所述荧光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。


5.如权利要求1-4任一项所述的系统，其中，所述scFv-synNotch-Cre元件包括信号肽、scFv、Flag、NotchCore和Cre重组酶。


6.如权利要求5所述的系统，其中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述scFv为可特异性识别实体肿瘤表面的特异性蛋白；所述NotchCore的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Cre重组酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


7.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，祝海川，张子健，周勇，顾潮江，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42