一种假病毒及其包装方法和药物评估系统技术方案

本发明专利技术涉及一种假病毒，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源优化的Spike表达序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。本发明专利技术的假病毒能够模拟野生型新型冠状病毒感染细胞的过程，可用于研究病毒与宿主细胞的关系、克隆病毒的受体，替代传统的中和试验，用于疾病的鉴别诊断、抗病毒药物的评估筛选及疫苗免疫效果的评价等研究。本发明专利技术还涉及该假病毒的包装方法和包含该假病毒的新冠病毒药物评估系统，其中假病毒用于在药物干扰的情况下感染所述过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞，通过检测假病毒中报告基因的表达量(如检测荧光强度等)，进而初步评估药物的有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种假病毒及其包装方法和药物评估系统
本专利技术涉及基因工程领域，尤其是涉及一种假病毒及其包装方法和药物评估系统。
技术介绍
在病毒功能研究中，最直接高效的手段当然是操作野生型活病毒。但对于新型冠状病毒这类致病性和传染性很强的病毒，操作野生型活病毒需要在三级以上生物安全防护(P3)实验室里进行，目前国内只有40多家P3实验室，大多属于CDC系统，非常规科研用途。且P3实验室为了防止生物危害，有非常苛刻的防护条件，极大降低了操作效率。为了能在二级生物安全实验室进行新冠病毒的相关研究，假病毒技术是一种非常有效的替代研究手段。与活病毒相比，假病毒具有相似的细胞感染特点，可以模拟野生型病毒感染细胞的早期过程，而且假病毒内携带的报告基因，可以快速方便地进行各种检测和分析。因此，假病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的关系、克隆病毒的受体，更重要的是可以替代传统的中和试验，用于疾病的鉴别诊断、抗病毒药物的评估筛选及疫苗免疫效果的评价等研究。SARS-CoV-2与SARS相似，具有相似的基因组构成和病毒结构特征，二者都是通过其包膜Spike蛋白的RBD(receptorbindingdomain)识别和结合位于靶细胞表面的ACE2(angiotensin-convertingenzyme2)受体，通过膜融合，进入内体/溶酶体途径达到感染。Spike(S)蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，其含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体。S2含有膜融合过程所需的基本元件。S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。同样地，包装一种用于模拟2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染机制的假病毒，S蛋白也成为其设计的关键要素。驱动S蛋白表达的启动子的筛选难度大。CMV是人们从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)中发现的强启动子。因此，只要CMV病毒能够感染的细胞，该启动子都能起始转录过程。是大家公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子。然而，在2004年，科学家在包装SARS-CoV假病毒系统时发现，在包装细胞中，CMV启动子无法驱动野生型S蛋白的表达，通过密码子优化，S蛋白的量虽有所增加，但仍无法弥补启动子的不足。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种假病毒及其包装方法，在包装假病毒过程中，通过选择和优化启动子，并结合SpikeDNA序列的人源表达优化，高效驱动S蛋白在包装细胞中的表达，极大地提高假病毒的感染活性。此外，本专利技术还提供了一种包含前述假病毒的药物评估系统。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一方面，本专利技术提供一种假病毒，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源表达优化的SpikeDNA序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。根据本专利技术的一较佳实施例，其中，所述报告基因含有用于表达绿色荧光蛋白GFP和/或荧光素酶luciferase的基因序列。根据本专利技术的一较佳实施例，其中，所述表达新冠病毒包膜蛋白Spike的质粒的基因序列为SEQIDNO:1。根据本专利技术的一较佳实施例，其中，报告基因质粒的基因序列为SEQIDNO:2或SEQIDNO:3。所述包装辅助质粒购买自Addgene,商品编号为Addgeneplasmid#12260。另一方面，本专利技术还提供一种假病毒的包装方法，其包括如下步骤：S1:将全长编码GFP或luciferase的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro质粒中，得到载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro，其中载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro的基因序列为SEQIDNO:2，载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQIDNO:3；S2:将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、pSpike过表达质粒及包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生假病毒；其中pSpike过表达质粒含有CBA启动子和人源表达优化的SpikeDNA序列。根据本专利技术较佳实施例，其中，S2中，所述pSpike过表达质粒的制备方法为：(1):将CBApromoter亚克隆到PBSK-MCS质粒中，纯化得到启动子载体质粒PBSK-CBA；(2):将SpikeDNA序列进行人源表达优化，得到Spike-optDNA序列，然后将Spike-optDNA序列亚克隆到启动子载体质粒PBSK-CBA中，产生基因序列为SEQIDNO:1的pSpike过表达质粒。根据本专利技术较佳实施例，其中，S2中，将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、所述pSpike过表达质粒及包装辅助质粒psPAX2，共转染前一天接种于10层细胞工厂的293T细胞，转染后6小时更换新鲜培养基，72小时后收取上清液用于层析纯化，得假病毒。本专利技术中用到的包装辅助质粒为购买自Addgene,商品编号为Addgeneplasmid#12260。根据本专利技术较佳实施例，S2纯化过程是使用GE的AKTAavant层析系统，采用DEAE层析，切向流过滤和core700层析纯化工艺，纯化得假病毒。再一方面，本专利技术提供一种新冠病毒药物评估系统，其包括：上述的假病毒；以及过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株；所述假病毒用于在药物干扰的情况下感染293T单克隆细胞，通过计数GFP阳性抗性克隆数或读取luciferase荧光强度来表征假病毒的感染效率，进而初步评估药物的有效性。其中，所述过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞还用于评估假病毒的感染效率，对获得的假病毒感染性进行筛选。根据本专利技术较佳实施例，其中：过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株采用如下方法制备：步骤一：制备VSV-G伪型包装的慢病毒载体：将人ACE2全长编码区亚克隆到慢病毒基因转移载体pLVX-IRES-BSD中，得到编码ACE2受体的载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD，其基因序列为SEQIDNO:4；将载体质粒pLVX-ACE2-IRES-BSD、包膜蛋白质粒和包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD；步骤二:获得过量表达人ACE2基因的293T单克隆细胞株利用VSV-G伪型包装的慢病毒LVX-ACE2-IRES-BSD感染293T细胞，加入抗生素blasticidin筛选并单克隆化，获得过量表达ACE2的293T混合克隆和单克隆细胞株。其中，所用的包膜蛋白质粒为pMD2.G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假病毒，其特征在于，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源表达优化的Spike DNA序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种假病毒，其特征在于，其包括：表达包膜蛋白Spike的质粒、报告基因质粒和包装辅助质粒；所述表达包膜蛋白Spike的质粒中含有CBA启动子和人源表达优化的SpikeDNA序列，用于驱动包膜蛋白Spike的表达。


2.根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述报告基因含有用于表达绿色荧光蛋白GFP和/或荧光素酶luciferase的基因序列。


3.根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述表达新冠病毒包膜蛋白Spike的质粒的基因序列为：SEQIDNO:1。


4.根据权利要求1或2所述的假病毒，其特征在于，报告基因质粒的基因序列为SEQIDNO:2或SEQIDNO:3。


5.一种假病毒的包装方法，其包括如下步骤：
S1:将全长编码GFP或luciferase的cDNA亚克隆到pLVX-IRES-Puro质粒中，得到载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro，其中载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro的基因序列为SEQIDNO:2，载体质粒pLVX-luciferase-IRES-Puro的基因序列为SEQIDNO:3；
S2:将载体质粒pLVX-GFP-IRES-Puro或pLVX-luciferase-IRES-Puro、pSpike过表达质粒及包装辅助质粒，共转染293T细胞，产生假病毒；其中pSpike过表达质粒含有CBA启动子和人源表达优化的SpikeDNA序列。


6.根据权利要求5所述的假病毒，其特征在于，S2中，所述pSpike过表达质粒的制备方法为：
(1):将CBApromoter亚克隆到PBSK-MCS质粒中，纯化得到启动子载体质粒PBSK-CBA；
(2):将SpikeDNA序列进行人源表达优化，得到Spike-optDNA序列，然后将Spike-optDNA序列亚克隆到启动子载体质粒PBSK-CBA中，产生基因序列为SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：董文吉，赵忠亮，刘子瑾，张艳君，程谟斌，李昌锋，
申请(专利权)人：中吉当康北京基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11