一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其构建的重组病毒与应用。本方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该方法构建的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株在UL13基因部位发生特异性缺失突变。所得伪狂犬病毒基因缺失弱毒株诱导的I型IFN基因表达量显著提高，能产生更强的天然免疫反应，而病毒自身的复制无显著差异。因此，UL13基因缺失突变能显著降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，具有重要的潜在应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用
本专利技术涉及一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用。
技术介绍
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)感染引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者，伪狂犬病毒感染可引起母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪神经紊乱及死亡和育肥猪呼吸道疾病等。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，给该病的防控增加了新的难题。预防猪伪狂犬病最行之有效的办法是接种疫苗，但经典的Bartha-K61弱毒疫苗免疫所产生的抗体对目前流行毒株的中和能力弱，已经不能提供高效的保护。针对当前猪伪狂犬病的流行现状，有必要对经典疫苗株Bartha-K61或变异毒株进行改造，研制免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗，有效的预防和控制猪伪狂犬病。宿主天然免疫系统是抵抗感染的第一道防线。为了适应宿主细胞，甲型疱疹病毒如伪狂犬病毒等进化出了多种策略拮抗宿主抗病毒免疫反应，这些免疫逃逸策略对于甲型疱疹病毒在宿主体内建立持续感染具有重要意义。例如，研究显示伪狂犬病毒强毒株感染能够显著抑制干扰素(Interferon，IFN)诱导的STAT1的活化及其下游ISGs的表达，表明伪狂犬病毒能够抑制宿主IFN介导的抗病毒免疫反应。另外，研究发现伪狂犬病毒脱氧尿苷磷酸酶UL50和间质蛋白US3均能抑制IFN-STAT信号通路活化。综上所述，伪狂犬病毒能够通过多种病毒蛋白抑制宿主抗病毒天然免疫反应。
技术实现思路
>本专利技术所要解决的技术问题是如何降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，通过构建免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗株，来实现对猪伪狂犬病的有效预防和控制。伪狂犬病毒UL13基因编码一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在病毒的成熟、组装及复制过程中发挥重要作用。我们首次发现，间质蛋白UL13是伪狂犬病毒导致宿主免疫抑制的关键蛋白，能够显著抑制宿主IFN以及下游ISGs的表达，从而抑制宿主天然免疫和促进病毒的免疫逃逸。因此，构建伪狂犬病毒UL13基因缺失株是开发新型伪狂犬病毒基因缺失疫苗的一种有效手段。本专利技术提供了一种构建重组伪狂犬病毒的方法，包括降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。上述方法中，所述UL13蛋白为如下A1)或A2)的蛋白质：A1)其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistencecost，Perresiduegapcost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。上述方法中，所得重组伪狂犬病毒诱导的宿主I型IFN表达量高于所述目的伪狂犬病毒，且复制能力与所述目的伪狂犬病毒没有显著差异。上述方法中，所述降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，是通过抑制目的伪狂犬病毒中所述UL13基因的表达或敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因实现的。上述方法中，所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。所述CRISPR/Cas9基因编辑技术以UL13的编码基因中符合5’-N20-NGG-3’或5’-CCN-N20-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，N20表示20个连续的脱氧核糖核苷酸；进一步地，所述靶序列是脱氧核糖核苷酸序列分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.3两个序列。所述CRISPR/Cas9基因编辑技术包括包含sgRNA的载体，所述sgRNA的序列是核苷酸序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5的两个单链DNA。上述方法中，所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒Bartha-K61株。由上述的方法构建的重组伪狂犬病毒也属于本专利技术的保护范围。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，所述物质为降低伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低伪狂犬病毒中所述UL13基因的物质。上述应用中，所述物质为以下B1)-B5)中的任一种：B1)核苷酸序列分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.5的两个单链DNA；B2)编码所述sgRNA的核酸分子；B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。所述重组载体的重组微生物为重组伪狂犬病毒。所述重组伪狂犬病毒可为上述方法构建的重组伪狂犬病毒。本专利技术还提供下述任一种应用：P1、上述的方法、上述的重组伪狂犬病毒或上述的应用在制备伪狂犬病毒疫苗中的应用或在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用；P2、上述的物质在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用。所述调控伪狂犬病毒免疫抑制可为提高伪狂犬病毒感染后宿主I型IFN基因的表达量。本专利技术所述重组伪狂犬病毒理解为不仅包含第一代到第二代重组病毒，也包括其子代。本方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该方法构建的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株在UL13基因部位发生特异性缺失突变。所得伪狂犬病毒基因缺失弱毒株感染宿主细胞后诱导的I型IFN及下游ISG基因表达显著提高，而病毒自身的复制无显著差异。因此，UL13基因缺失突变能显著降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，具有重要的潜在应用价值。附图说明图1为实施例1中转化pX459M-gRNA1后菌落的4PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000DNAmarker)，1为菌落单克隆1号样品，2为菌落单克隆2号样品。图2为实施例1中转化pEZ-gRNA2后菌落的PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000DNAmarker)，1为菌落单克隆①号样品，2为菌落单克隆②号样品。图3为实施例1中转化重组载体pX459M-gRNA1/2后菌落的PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000DNAmarker)，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于：包括降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于：包括降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述UL13蛋白为如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示；
A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所得重组伪狂犬病毒诱导的宿主I型IFN基因表达量高于所述目的伪狂犬病毒。


4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，是通过抑制目的伪狂犬病毒中所述UL13基因的表达或敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因实现的。


5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述敲除所述目的伪狂犬病毒中...

【专利技术属性】
技术研发人员：商营利，孔正杰，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37