一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法，该猪流行性腹泻病毒重组疫苗株是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。其中PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。该重组疫苗株毒株生长特性良好，已传至60余代，遗传稳定性好，病毒滴度达10

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水，死亡率很高，尤其是未断奶仔猪。2010年以来，因PED的大范围流行，我国养猪业遭受了重大经济损失，甚至威胁到了国家肉食品安全供应。2013年3月以后，PED首次在美国报道，并迅速蔓延至其他美洲、欧洲国家；亚洲其他国家也相继报道PED疫情的暴发。目前，PED已蔓延至全球，给全世界养猪业的疾病防控带来了严峻的挑战。该病近些年来呈现了新的流行特征，表现为死亡率极高(90-100％)、患病仔猪日龄更低、疫苗防控效果很差，这些现象与长期免疫压力下的PEDV基因变异导致免疫原性及毒力改变有关，因此急需研制针对新流行毒株的新一代PEDV疫苗。近年来，国内外的研究者在PED疫苗方面已经做了大量的研究工作，但到目前为止，还没有研制出特别有效的PED疫苗用以控制PED的发生。韩国、日本等国家广泛使用的PED疫苗是传统的活苗和灭活苗，所有的灭活苗和传代致弱的减毒疫苗都能减少死亡率，但不能显著地减少发病率和病毒载量。2014年，美国批准两个疫苗上市，分别是RNA疫苗和灭活的全病毒疫苗，美国猪场使用这两种疫苗，均能减少猪的死亡率，然而缺乏临床使用的免疫相关性和免疫效率数据的相关报道。加拿大、欧洲商品化的PED疫苗主要是基于灭活的病毒与佐剂组成的灭活疫苗。国内市场已经商品化的PED疫苗都是联苗，主要是猪传染性胃肠炎(TGEV)与PEDV的二联灭活苗或者二联弱毒苗，目前已经有8个PED疫苗获得了新兽药证书，涉及的PED疫苗毒株有7个，分别为CV777株及其致弱毒株CV777，AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R，弱毒株ZJ08株，SCSZ株和LW/L株。近年来，随着PED疫情的流行，以CV777毒株为代表的经典毒株生产的疫苗起不到有效的保护，造成免疫失败的现象屡屡发生。流行毒株产生的疫苗针对性强，但免疫效果也良莠不齐。
技术实现思路
针对现有PEDV商品化疫苗保护效力在逐年降低问题，本专利技术提供了一种以PED经典毒株DR13为骨架的重组疫苗株，该重组疫苗株具有流行毒株的免疫原性，能有效地保护新生仔猪。为了实现上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。所述的PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。根据NCBI中KF650375的S基因的序列，设计并合成引物SEQIDNO.19～102，其中S-1(1-623bp)以pJET1.2/blunt.Q4(实验室保存质粒含KF294254S基因1-1366bp)为模板，PED232PED233为引物，扩增S-1片段，S-6(2654-3183bp)以pJET1.2/blunt.Q2(KF294254S基因2845-3731bp)为模板，PED234PED235为引物扩增S-6片段。其余片段通过引物长度59bp，相邻引物间重叠21bp，通过引物小片段PCR融合，从一级片段逐级放大至四级片段，合成出PED流行毒株S基因。在本专利技术的另一方面，提供了上述重组疫苗株的制备方法，包括以下步骤：1)以PED经典毒株DR13基因为模板，设计引物对B；2)进行PCR扩增得到p-PEDV-ΔSDR13片段；3)将PED流行毒株S基因用带有同源臂的引物对C扩增，在同源重组酶的作用下，PED流行毒株S基因就定向与p-PEDV-ΔSDR13片段连接，形成重组的转移载体。进一步的，步骤(1)中引物对B为：上游引物：ttttgaaaaggtccacgtgcagtga；下游引物：tcatttgtttacgttgaccaaatga。进一步的，步骤(3)中引物对C为：上游引物：ctaatcatttggtcaacgtaaacaaatgaagtctttaacctactctggt；下游引物：gtgtattgaaaaagtccaagaaacatcactgcacgtggaccttttcaaaa。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过靶向RNA重组反向操作技术，以PED经典毒株DR13为骨架，将主要抗原基因S基因替换成PEDV流行毒株S基因，构建出一株重组疫苗毒株。PEDV流行毒株ISU13-22-38-IA属于G2型，目前国内新发pedv流行毒株大部分都属于G2型，而S蛋白是诱导机体产生中和抗体和提供粘膜免疫保护作用主要的结构蛋白，因此重组疫苗毒株具有流行毒株的免疫原性。目前该毒株生长特性良好，已传至60余代，遗传稳定性好，病毒滴度达107TCID50，并开展了仔猪攻毒保护试验，证明了该毒株具有良好的免疫原性，并能有效地保护新生仔猪。附图说明图1是本专利技术rPEDVD375F基因结构图；图2是毒株rPEDV-D375F全基因组分段序列的PCR扩增；其中，M1.markerDL15000；1.4000bpDNA序列；2.7500bpDNA序列；3.7500bpDNA序列；4.4000bpDNA序列；5.3700bpDNA序列；6.3761bpDNA序列；图3是本专利技术免疫组化检测结果；其中，A:感染rPEDVD375F的细胞；B:感染PEDVDR13的细胞；C:细胞对照；图4是本专利技术骨架病毒PEDVDR13和重组病毒rPEDV-D375F的生长曲线；图5是本专利技术实施例两组仔猪5天存活情况对比；图6是本专利技术实施例母猪IgG抗体水平监测；图7是本专利技术实施例仔猪IgG抗体水平监测。具体实施方式下面将结合本专利技术具体的实施例，对本专利技术技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因工程疫苗株rPEDVD375F的构建通过靶向RNA重组反向操作技术(LiC,LiZ,ZouY,etal.ManipulationofthePorcineEpidemicDiarrheaVirusGenomeUsingTargetedRNARecombination[J].PLoSONE,2013,8(8):e69997.)，以PED经典毒株DR13为骨架，将主要抗原基因S基因替换成PEDV流行毒株ISU13-22-38-IA的S基因,并在S基因内引入一个突变位点作为人工标记(S蛋白892引入突变V变成R)，构建出一株重组疫苗株(图1)。1)将纯化后的病毒rPEDVD375F在细胞上连续传代，以P36代病毒为模板，用1-6号引物进行全基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，其特征在于，是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，其特征在于，是以PED经典毒株DR13为骨架，将抗原基因S基因替换成PED流行毒株S基因。


2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒重组疫苗株，其特征在于，所述的PED流行毒株S基因来源于美国流行毒株KF650375。


3.权利要求2所述的PED流行毒株S基因的制备方法，其特征在于，根据NCBI中KF650375的S基因的序列，设计并合成引物，通过引物小片段PCR融合，从一级片段逐级放大至四级片段，合成出PED流行毒株S基因。


4.根据权利要求3所述的PED流行毒株S基因的制备方法，其特征在于，所述的引物具体如SEQIDNO.19～102所示。


5.权利要求1所述的重组疫苗株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以PED经典毒株DR13基因为模板，设计引物对B；
2)进...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈冰清，李震，董世娟，于瑞嵩，司伏生，谢春芳，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31