一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物制药与肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L及其应用。本发明专利技术公开了一种新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L的设计和构建方法，成功获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内选择性复制，并且能够高表达可溶性蛋白sCD137L，该蛋白能够分泌到细胞外肿瘤微环境局部，激活病毒所招募的浸润性淋巴细胞的共刺激信号受体CD137，发挥生物学功能。实验表明，本发明专利技术的新型复制型溶瘤腺病毒AD5 sCD137L具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，具有显著的抗肿瘤活性和安全性，有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物制药和肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。
技术介绍
癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，我国每年新增癌症病例400多万，近300万人死于癌症。抗癌药物的研发一直是药学研究的热点，包括传统的化疗，本世纪初涌现的小分子靶向抗癌药物治疗，发展到目前颇具突破性肿瘤免疫治疗。抗肿瘤免疫治疗不断出现的令人振奋的临床研究结果，给肿瘤患者带来了希望。免疫系统具有识别并清除异己的能力，肿瘤在发生发展过程中不仅通过多种途径抑制免疫系统的先天性免疫反应，也通过限制自身“新抗原的展示”和启动免疫检查点等诸多方法来“麻痹”抗肿瘤的免疫效应细胞，从而逃避免疫识别和免疫清除。T细胞的活化除了TCR介导的第一信号，还需要一些特异性的共刺激分子辅助。如果缺少共刺激分子提供的信号，T细胞不能完全活化并执行抗肿瘤作用。效应T细胞膜表面的CD137是一个重要的免疫共刺激分子。利用抗体激活该通路，可以活化抗肿瘤免疫。然而，仅仅单独活化CD137通路治疗肿瘤的效果局限；更重要的是，系统性给与激活CD137的抗体，由于缺乏靶向性，使非肿瘤部位的效应T细胞，比如身体其它正常组织，也同样被活化，往往引起免疫活化过度，释放大量细胞因子导致严重全身反应(细胞因子风暴)。病毒作为外来侵入颗粒，能够有效激活机体的天然免疫和适应性免疫。随着溶瘤病毒T-Vec在2015年底被FDA批准上市，用于复发黑色素瘤不能手术患者的治疗，在肿瘤局部注射。溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗受到高度关注。我们设想，溶瘤病毒免疫疗法是否可以使肿瘤对活化效应T细胞CD137的治疗更加敏感，从而解决单独活化CD137抗肿瘤效果不理想的难题。另外，利用溶瘤病毒在肿瘤局部注射(目前批准的溶瘤病毒都是肿瘤局部注射)，并能够在肿瘤细胞内选择性复制的巨大优势，构建一个新型的重组溶瘤病毒，使其在肿瘤局部高表达淋巴细胞的活化型受体CD137的配体－－CD137L分子的胞外区(sCD137L)，该分子不同于膜结合型CD137L，能够被分泌到细胞外，与T细胞表面的活化型受体CD37特异性地结合并激活T细胞，起到有效的抗肿瘤免疫作用。溶瘤病毒所表达的sCD137L能够被局限在肿瘤的局部微环境，从而避免引起其它非肿瘤组织中的淋巴细胞被激活，有效降低“脱靶”造成的免疫过激性“误伤”，提高治疗的安全性。本专利技术设计了一种构建新型复制型溶瘤腺病毒AD5sCD137L的方法，获得了一株新型复制型溶瘤腺病毒AD5sCD137L，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位特异性复制，并且能够高表达活化型配体分子CD137L的胞外区(sCD137L)，该蛋白能够被分泌到细胞外，在肿瘤局部特异性激活效应T细胞上的CD137，发挥活化免疫的生物学功能。药理学实验表明，本专利技术的新型复制型溶瘤腺病毒AD5sCD137L具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，能产生显著的抗肿瘤作用，具有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。目前，缺乏一种能够同时提供T细胞活化第二信号的特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够同时传递T细胞活化第二信号的特异性激活免疫共刺激通路的复制型溶瘤腺病毒及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：本专利技术的一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，所述的病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性蛋白，所述的可溶性蛋白为结合CD137的CD137L。进一步地，所述的可溶性蛋白为sCD137L，sCD137L的氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:4所示。本专利技术所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的复制型溶瘤腺病毒能够溶瘤。本专利技术所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。本专利技术所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。本专利技术所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。进一步地，所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或者乳腺癌。8.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒AD5sCD137L的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)AD5sCD137L质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttle-sCD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5sCD137L质粒；(2)AD5sCD137L病毒拯救：AD5sCD137L质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO2、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种；(3)病毒扩增：取病毒种液50ul加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO237℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。进一步地，在步骤(1)中，AD5sCD137L病毒构建CD137L胞外区(sCD137L)的基因克隆以及携载sCD137L基因的腺病毒穿梭质粒的构建小鼠CD137L属于膜蛋白，其结构依次是:N端信号肽-胞外区-跨膜区-胞内区C端；CD137L与CD137结合的功能单位是胞外区，使用CD33的N端信号肽序列和CD137L胞外区序列；可溶性蛋白sCD137L的基因克隆：分别设计合成引物CD137L-F、CD137L-R、使用CD137L-F和CD137L-R引物，以小鼠脾脏cDNA为模板扩增得到片段EXO-CD137L；所述的EXO-CD137L的氨基酸序列和信号肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示；所述的EXO-CD137L的核苷酸序列和信号肽的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。进一步地，在步骤(1)中，携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒AD5-pShuttle-sCD137L载体的构建：使用Infusion技术将sCD137L片段与AD5-pShuttle(pZD55)连接；具体步骤：首先使用限制性内切酶BglII对AD5-pShuttle(pZD55)线性化，纯化后片段按照sCD137L：AD5-pShuttle的2:1比例使用Infusion试剂盒(clontechlab.Inc.)进行连接，后经转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性蛋白，所述的可溶性蛋白为结合CD137的CD137L。/n

【技术特征摘要】
1.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性蛋白，所述的可溶性蛋白为结合CD137的CD137L。


2.如权利要求1所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的可溶性蛋白为sCD137L，sCD137L的氨基酸序列和核苷酸序列分别如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:4所示。


3.权利要求1或2所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的复制型溶瘤腺病毒能够溶瘤。


4.权利要求1或2所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。


5.权利要求1或2所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。


6.权利要求1或2所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。


7.如权利要求1或2所述的激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或者乳腺癌。


8.一种激活免疫共刺激信号通路的复制型溶瘤腺病毒AD5sCD137L的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)AD5sCD137L质粒构建：将构建好的穿梭载体AD5-pShuttle-sCD137L用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5sCD137L质粒；
(2)AD5sCD137L病毒拯救：AD5sCD137L质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1ug/well转染293T细胞，5％CO2、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏继武，张永辉，张海林，吴俊华，董杰，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32