一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒技术

本发明专利技术公开了一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒，该制备方法利用Vero细胞制备溶瘤病毒（特别是VSV病毒），首先利用Vero细胞优化病毒扩增条件，包括优化病毒感染复数（MOI）、病毒稀释液、病毒扩增液、扩增时血清浓度、细胞培养体积、病毒收获时间等条件；进一步通过优化病毒纯化条件，包括优化离心力、蔗糖垫底离心、离心时间、分步离心等条件，发现VSV病毒粒子在3%FBS培养基中，按MOI=5的比例感染Vero细胞48h，收获病毒液，在4℃、26000×g离心1h后，进行28000×g离心（30min‑45min）确定在分步离心条件下能稳定制备出高滴度的VSV病毒。该制备方法能高效、稳定、节约成本，为后续VSV病毒的规模化生产提供了技术支持，可用于制备抗肿瘤用的病毒药物。

【技术实现步骤摘要】
一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒。技术背景Vero细胞是非洲绿猴肾脏细胞，是一种连续传代细胞系。该细胞的优点在于其质量和外源因子可控性高，繁殖速度快，能高密度生长，并具有微载体培养工艺化生产的优势，同时该细胞为干扰素分泌缺陷型细胞，因而对于病毒，如VSV病毒（水疱性口炎病毒）的复制影响较小，可扩增出高低度的病毒颗粒。Vero细胞可用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞，1982年Vero细胞已被WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质，如脊髓灰质炎疫苗和狂犬疫苗的生产。癌症和常规的癌症治疗剂目前在情绪/身体痛苦、失去生命和增加医疗保健成本方面带来了显著的社会经济负担。常规的疗法显示出一些有益的临床效果但是伴随着产生降低患者的生活质量的毒副作用。临床治疗中需要有更有效的且更低的毒副作用的癌症疗法。目前小分子药物、单克隆抗体等被开发应用于肿瘤的新型治疗，但治愈率不高，有待更多的研究。另外，仅用单一药物治疗可能会导致肿瘤细胞出现耐药性，因此急需开发有效的生物治疗方法。溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，经过高度稀释的减毒病毒能利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡，而在正常细胞内它只是少量存在或不能增殖。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制，导致细胞溶解和死亡；而且通过死亡的细胞释放出病毒颗粒，产生一种级联效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤细胞被清除。同时，肿瘤细胞的破裂会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应，这可能会增强病毒的溶细胞活性。溶瘤病毒进入肿瘤细胞后由于自我复制可陆续破坏宿主细胞，进而向周围扩散，进入其他肿瘤细胞。如此反复循环，可发挥有效的抗肿瘤效果。随着RNA病毒遗传技术的进展，水疱性口炎病毒属载体已被开发成为一种有效的治疗制剂。VSV（水疱性口炎病毒）载体是一种高效的溶瘤弹状病毒载体，具有非常广的溶瘤范围。根据资料报道，VSV载体几乎能够侵染溶解所有的肿瘤细胞，在体外实验中VSV载体的溶瘤率都在50%以上，在体内实验中VSV载体能够显著延长荷瘤动物模型的寿命。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体，VSV载体作为疫苗载体应用到获得性免疫缺陷综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。因此水疱性口炎病毒载体具有非常好的应用前景。VSV为弹状病毒科成员，是一种不分节段单股负链RNA病毒，病毒基因组长约11kb并且不会整合到宿主基因组内，主要以节肢动物为传播媒介，可感染大多数哺乳动物。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。尽管有报道表明VSV可感染人，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白，包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。VSV病毒颗粒呈子弹状或圆柱状，长度约为直径的3倍（150-180nm×50-70nm），病毒粒子表面有囊膜，囊膜上均匀密布短的纤突，长约10nm。VSV病毒粒子分子量为265.6×103±13.3×103KD，其中蛋白占74%，类脂质占20%，糖类占3%，RNA占3%。虽然利用Vero细胞制备某些病毒的工艺已经相对成熟稳定，但VSV对各种理化因子的抵抗力不强。58℃30min、可见光、紫外线、脂溶剂（乙醚、氯仿）、高的离心力、高盐等条件都能使其失活。因而对VSV病毒的生产浓缩工艺提出了较高的要求。病毒纯化过程是临床转移治疗中的一个重要步骤，就纯度和滴度而言与安全性和功效直接相关。特别是在严格的监管规则下，对病毒疫苗产品中宿主细胞的污染物有强制要求，如宿主细胞蛋白质和DNA水平、牛血清白蛋白、抗生素、支原体、菌体等；在大多数小规模的实验应用中，可采用离心技术通过相对简单的方法来浓缩和纯化病毒载体。在过去的几十年里，大量的技术进步显著增加了病毒生产工艺的生产效率和可扩展性。相比之下，由于回收率通常很低，病毒纯化技术仍须提升。目前，病毒的纯化，主要包括PEG浓缩、超速离心浓缩、柱浓缩（离子交换柱、亲和柱、分子筛等）、超滤浓缩、透析等，其中PEG浓缩法虽然能够获得较高的病毒回收率，但是PEG的存在却限制了溶瘤病毒的后期应用，如病毒的安全性评价实验等。而柱浓缩和超滤浓缩因为价格昂贵，不适用于实验室阶段的研究，并且柱浓缩需要一定量的高盐溶液洗涤，这会造成VSV病毒极大的失活，从而导致感染性病毒粒子的回收率偏低。总的来说，这些操作方法造成了病毒的大量损失，极大的增加了病毒疫苗生产成本。为了提升效率和可扩展性，病毒生产工艺技术不断优化，病毒颗粒的纯化成为病毒疫苗生产领域重大的技术诀窍。病毒制备方法一般包括从稳定细胞系制备病毒和使用例如色谱法、蔗糖梯度离心法等纯化病毒。并且在工业过程中，通常使用至少一个超滤步骤或离心步骤以浓缩病毒和/或交换保持病毒载体的缓冲液。综上所述，一种能够稳定、高效、节约成本的VSV制备方法及高速离心纯化VSV病毒的生产工艺，将会具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在基于现有技术中存在的问题，提供一种利用Vero细胞高效稳定制备溶瘤病毒的方法以及一种能有效纯化溶瘤病毒的方法。本专利技术采用的技术方案为，一种制备溶瘤病毒的方法，将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3%的FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液，培养36-48h后收获病毒液。进一步地，该方法包括以下具体步骤：S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入Vero-E6细胞（ATCC）悬液，体积为2mL，使细胞量达到4×105个/孔，37℃，体积百分比为5%CO2培养16h；S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数，其余孔的细胞分别按MOI=5将病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基，将经过细胞消化后的液体分别加入到其余孔中，在37℃，体积百分比为5%CO2条件下感染1h-3h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在Vero细胞中扩增和复制，具备反复侵染Vero细胞的能力；S3、吸弃病毒液，加入含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基0.5-2mL作为病毒扩增液，在37℃、体积百分比为5%CO2的条件下培养36-48h，离心、并使用滤器进行过滤备用。进一步地，其中S3中，吸弃病毒液，加入含重量体积浓度为3%的FBS的DMEM培养基0.75-1mL，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养36h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。进一步地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3-10%FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液，培养36-48h后收获病毒液。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3-10%FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液，培养36-48h后收获病毒液。


2.根据权利要求1所述的一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入Vero-E6细胞（ATCC）悬液，体积为2mL，使细胞量达到4×105个/孔，37℃，体积百分比5%CO2培养16h；
S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数，其余孔的细胞分别按MOI=5将
病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基，将经过细胞消化后的液体分别加入到其余孔中，在37℃，体积百分比5%CO2条件下感染1h-3h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在Vero细胞中扩增和复制，具备反复侵染Vero细胞的能力；
S3、吸弃病毒液，加入含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基0.5-2mL作为病毒扩增液，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养36-48h，离心、并使用滤器进行过滤备用。


3.根据权利要求2所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，其中S3中，吸弃病毒液，加入含体积百分比为3%的FBS的DMEM培养基0.75-1mL，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养36h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。


4.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，所述病毒为重组溶瘤弹状病毒，选自水疱性口炎病毒。


5.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓峰，吴飞，韦治明，
申请(专利权)人：惠君生物医药科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33