快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法：(1)将鸭坦布苏病毒亲本病毒株全基因组分为三个片段进行PCR扩增，在第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子序列，在第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号序列；纯化，构成鸭坦布苏病毒感染性亚基因组复制子；(2)转染鸭胚成纤维细胞，在细胞内自发进行同源重组，并转录形成具有感染性的完整病毒转录本，继而包装出成熟的病毒粒子，获得反向遗传株病毒。本发明专利技术获得的含有遗传标记的拯救病毒在DEF细胞上的增殖能力和病毒滴度与亲本病毒相似，且遗传稳定性良好。本发明专利技术为研究该病毒的基因功能、致病机理、新型疫苗开发等提供了有利的工具。

【技术实现步骤摘要】
快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法
本专利技术涉及一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，属于分子生物学

技术介绍
鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒(DuckTembusuvirus，DTMUV)感染引起的高度接触性传染病，以产蛋急剧下降、采食量减少、神经症状、发病率高、传染性强为主要特征。自2010年4月份以来，该病首先发生于福建、浙江等地，后迅速蔓延至江苏、安徽、河南、山东、河北等主要鸭产区，该病已成为我国主要鸭病之一，给我国的养鸭业造成了巨大的损失。DTMUV属于黄病毒科、黄病毒属，病毒粒子大体呈球形，直径40-60nm，病毒核酸为单股正链RNA，基因组的大小约是11kb，仅有一个开放阅读框，编码一个能加工成所有病毒蛋白的多聚蛋白。反向遗传学技术是通过构建病毒感染性分子克隆，在DNA水平上进行基因敲除、定点突变等人工分子操作，从而研究病毒的结构、功能、病毒与宿主相互作用的方法，是开展病毒分子生物学研究的一种重要平台。传统的DTMUV反向遗学传操作技术首先是通过一定的策略，将全长基因克隆到质粒载体上，构建病毒全长基因组的克隆，然后利用RNA聚合酶按照体外转录的分子生物学方法制备DTMUV具有感染性的转录本，最后将所得到的转录本转染导入相关的易感细胞内，拯救出病毒。但是这种传统的反向遗传学操作技术还存在一些未解决的问题，比如将病毒基因通过小片段连接成全长基因组的克隆过程中酶切位点选取限制较多，连接效率较低；病毒基因组需要克隆到合适的载体中，cDNA克隆在细菌中具有不稳定性，易发生变异等。因此传统的反向遗传学操作过程步骤繁琐，而且耗时较长，成功率不高。目前，一种新型的被称为“感染性亚基因组复制子(InfectiousSubgenomicAmplicons，ISA)”的“无细菌”反向遗传学方法已被用于日本脑炎病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒、黄热病病毒、登革病毒等病毒的反向遗传学研究。该技术首先利用高保真聚合酶通过PCR方法产生包含整个病毒基因组的重叠的非感染性亚基因组DNA片段，相邻之间的片段之间具有重叠区域，同时，第一个片段的5'端包含巨细胞病毒早期启动子(Cytomegalovirusimmediateearlypromoter，pCMV)序列、最后一个片段3'末端包含丁型肝炎病毒核酶(Hepatitisdeltaribozyme，HDR)序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号(Simianvacuolatingvirus40polyadenylationsignal，SV40pA)序列，然后将获得的片段直接转染病毒易感细胞，并在宿主细胞内自发同源重组，进而转录形成具有感染性的完整病毒转录本，最终拯救获得具有感染性的病毒株。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术利用ISA技术，提供了一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，利用该方法可快速、简便构建DTMUV突变株。本专利技术利用ISA技术建立了简便、高效的DTMUV“无细菌”反向遗传系统，避免了传统的DTMUV反向遗传操作过程中分子克隆不稳定、步骤繁琐、耗时较长且成功率不高等问题，为研究该病毒的基因功能、致病机理、新型疫苗开发等提供了有利的工具。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，包括如下步骤：(1)将鸭坦布苏病毒亲本病毒株全基因组分为三个片段进行PCR扩增，在第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子序列，在第三个片段的NS5基因中引入同义突变作为遗传标记位点，并在3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号序列；纯化获得的三个DNA片段，构成鸭坦布苏病毒感染性亚基因组复制子；(2)将上述构建的感染性亚基因组复制子与转染试剂混匀转染鸭胚成纤维细胞(DEF)后，在细胞内自发进行同源重组，并转录形成具有感染性的完整病毒转录本，继而包装出成熟的病毒粒子，获得含有遗传标记的鸭坦布苏病毒反向遗传株病毒，记为DTMUV-D1D2D3。进一步的，所述步骤(1)具体为：(1a)以DTMUV亲本病毒株为材料，将病毒全基因组分为三个片段，并进行人工合成；三个片段分别记为DF1、DF2和DF3，分别含有4814个、3009个和4285个碱基对，DF1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，DF2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，DF3的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；DF1与DF2含有85个碱基对的重叠区域，DF3与DF2含有83个碱基对的重叠区域；DF1的5'端添加有巨细胞病毒早期启动子pCMV序列，DF3的3'末端添加有丁型肝炎病毒核酶序列HDR序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号序列SV40pA序列；在DF3的NS5基因中引入了一个同义碱基突变——第9052位核苷酸由A突变为G(该突变没有改变蛋白氨基酸组成，可通过PCR方法结合DNA测序来区分反向遗传株病毒与亲本毒株)；(1b)以人工合成的三个基因片段为模板，利用高保真聚合酶进行PCR扩增，纯化并测序；对DF1、DF2和DF3进行PCR扩增的引物分别如下：D1-F：CACCCAACTGATCTTCAGCATC；如SEQIDNO：4所示；D1-R：GAGAGGATTCCCAGGGTTAGC；如SEQIDNO：5所示；其扩增产物DF1的片段大小为4814bp，扩增产物DF1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；D2-F：CACTTGTTAGCTTGCTGGCTC；如SEQIDNO：6所示；D2-R：TGCTCCAGGTTTCTTGATGAC；如SEQIDNO：7所示；其扩增产物DF2的片段大小为3009bp，扩增产物DF2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；D3-F：AATGGGTTGGCTAGAGCAAAC；如SEQIDNO：8所示；D3-R：CTCAGGGTCAATGCCAGCGCT；如SEQIDNO：9所示；其扩增产物DF3的片段大小为4285bp，扩增产物DF3的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。进一步的，所述步骤(2)具体为：将转染试剂与DF1、DF2和DF3混匀，并转染DEF，在细胞内自发进行同源重组，并转录形成具有感染性的完整病毒转录本，继而包装出成熟的病毒粒子，获得含有遗传标记的鸭坦布苏病毒反向遗传株病毒。进一步的，在步骤(2)之后还包括对反向遗传株病毒进行鉴定的步骤(3)，具体包括：(3a)根据片段DF3中NS5基因引入的同义碱基突变位置，设计引物，PCR扩增包含突变位点的基因片段，纯化并测序，进一步利用限制性内切酶对PCR产物进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；(3b)将第4代反向遗传株病毒DTMUV-D1D2D3与亲本毒株分别感染DEF单层细胞，进行间接免疫荧光试验，检测病毒蛋白的表达；(3c)将第4代反向遗传株病毒DTMUV-D1D2D3与亲本毒株分别感染DEF单层细胞，每隔12小时收集样品，检测TCID50，以Log10TCID50/ml来本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)将鸭坦布苏病毒亲本病毒株全基因组分为三个片段进行PCR扩增，在第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子序列，在第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号序列；纯化获得的三个DNA片段，构成鸭坦布苏病毒感染性亚基因组复制子；/n(2)将上述构建的感染性亚基因组复制子与转染试剂混匀转染鸭胚成纤维细胞后，在细胞内自发进行同源重组，并转录形成具有感染性的完整病毒转录本，继而包装出成熟的病毒粒子，获得含有遗传标记的鸭坦布苏病毒反向遗传株病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将鸭坦布苏病毒亲本病毒株全基因组分为三个片段进行PCR扩增，在第一个片段的5'端添加巨细胞病毒早期启动子序列，在第三个片段的3'端添加丁型肝炎病毒核酶序列和猿猴病毒40多腺苷酸化信号序列；纯化获得的三个DNA片段，构成鸭坦布苏病毒感染性亚基因组复制子；
(2)将上述构建的感染性亚基因组复制子与转染试剂混匀转染鸭胚成纤维细胞后，在细胞内自发进行同源重组，并转录形成具有感染性的完整病毒转录本，继而包装出成熟的病毒粒子，获得含有遗传标记的鸭坦布苏病毒反向遗传株病毒。


2.根据权利要求1所述的快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，其特征在于：在第三个片段的NS5基因中引入同义突变作为遗传标记位点。


3.根据权利要求1或2所述的快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：
(1a)以DTMUV亲本病毒株为材料，将病毒全基因组分为三个片段，并进行人工合成；
三个片段分别记为DF1、DF2和DF3，DF1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，DF2的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，DF3的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；
(1b)以人工合成的三个基因片段为模板，利用高保真聚合酶进行PCR扩增，纯化并测序。


4.根据权利要求3所述的快速构建鸭坦布苏病毒反向遗传株的方法，其特征在于：所述步骤(1b)中，对DF1、DF2和DF3进行PCR扩增的引物分别如下：
D1-F：CACCCAACTGATCTTCAGCATC；如SEQIDNO：4所示；
D1-R：GAGAGGATTCCCAGGGTTAGC；如SEQIDNO：5所示；
D2-F：CACTTGTTAGCTTGCTGGCTC；如SEQIDNO：6所示；
D2-R：TGCTCCAGGTTTCTTGATGAC；如SEQIDNO：7所示；
D3-F：AATGGGTTGGCTAGAGCAAAC；如SEQIDNO：8所示；
D3-R：CTCAGGGTCAATGCCAGCGCT；如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡峰，李玉峰，于可响，郭效珍，刘存霞，刘丽萍，马秀丽，黄兵，高月花，王胜，宋敏训，吴家强，褚新星，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所山东省无特定病原鸡研究中心，山东和康源生物育种股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37