CRISPR-CAS9修饰的CD34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途制造技术

在一些实施方案中，本文提供使用自体CRISPR‑Cas9修饰的CD34+人造血干细胞和祖细胞治疗患有β‑地中海贫血的受试者和患有严重镰状细胞病的受试者的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CRISPR-CAS9修饰的CD34+人血色素干细胞和祖细胞及其用途相关申请本申请要求2017年12月5日提交的美国临时申请序列号62/594,689、2018年4月27日提交的美国临时申请序列号62/664,023、2018年5月15日提交的美国临时申请序列号62/671,770、2018年9月21日提交的美国临时申请序列号62/734,431和2018年9月21日提交的美国临时申请序列号62/734,543在35U.S.C.§119(e)下的权益，其各自的内容以引用的方式整体并入本文中。
技术介绍
血红蛋白(Hb)是由四种珠蛋白肽形成的四聚体，每种珠蛋白肽与含有铁原子的血红素基团紧密结合。在妊娠期间，血红蛋白的主要形式是胎儿血红蛋白(HbF)，其由两条α-珠蛋白链和两条γ-珠蛋白链组成。在出生前不久，存在从HbF到成人血红蛋白的转换，成人血红蛋白含有两个α-球蛋白多肽链和两个β-球蛋白多肽链。从HbF到成人血红蛋白的转换是由位于染色体11上的β-珠蛋白基因簇内的从γ-珠蛋白到β-珠蛋白的转录转换介导的。血红蛋白病是由影响血红蛋白分子的产生或功能的遗传缺陷引起的病症。血红蛋白病中最常见的两种是β-地中海贫血和镰状细胞病(SCD)。β-地中海贫血是世界范围内最常见的常染色体隐性疾病之一，在地中海(5-15％)、中东和西亚(2-5％)、东南亚(高达10％)和南亚(高达18％)人群中具有高患病率(Colah，R.等，2010.ExpertRevHematol3，103-117)。由于群体迁移，在北欧、北美和南美、加勒比海和澳大利亚也发现了β-地中海贫血。目前，估计全世界β-地中海贫血主要患者群体有200,000名，他们已登记并接受治疗(Galanello，R.，Origa，R.，2010.OrphanetJRareDis5，11.)。β-地中海贫血是由导致成人血红蛋白(HbA)产生减少或缺乏的一系列突变引起的。在发育的不同阶段产生不同形式的Hb。胎儿血红蛋白(HbF)是出生前并延续到新生儿期的主要Hb。HbF是含有2个γ-珠蛋白链和2个α-珠蛋白链的四聚体珠蛋白(a2γ2)。新生儿期后，Hb的主要形式是HbA，即由2个β-珠蛋白链和2个α-珠蛋白链组成的异四聚体(α2β2)。HbA通常占成人血液中总Hb的＞95％。输血依赖性β-地中海贫血(TDT)的治疗特别包括每3-6周进行的终身输血。输血疗法的目的是保持Hb水平≥9g/dL，以便改善严重贫血的症状和生理后遗症，并维持正常生长和发育。尽管慢性输血方案在预防疾病的标志性症状和身体表现方面是有效的，但它们引入了大的铁超载，其可以因铁相关的心脏和肝毒性而导致死亡。为了防止这种情况，用通常在早期起始的铁螯合方案来控制铁超载。对螯合方案的依从性差仍然是一项关键挑战。尽管目前的疗法有所改进，但生活质量差且到30岁的总存活率仅为55％。SCD是影响数百万人的最常见的单基因病症之一。据估计美国有超过100,000人受到影响，并且欧洲有约42,000人受到影响。SCD的最严重且最流行的形式，称为镰状细胞性贫血，是一种由于纯合突变引起的常染色体隐性疾病，在所述纯合突变中缬氨酸置换β-球蛋白中6位处的谷氨酸，导致脱氧血红蛋白聚合和红细胞(RBC)镰状化。SCD是一种慢性疾病，其特征在于复发性急性VOC，导致急性疼痛、慢性溶血、贫血、进行性组织损伤和器官功能障碍。所述疾病影响多个器官，引起急性和慢性并发症，诸如急性胸部综合征、中风、阴茎异常勃起、脾隔离症、骨坏死、肾衰竭、肺动脉高压、肝病、骨损伤、生长受限、对感染的易感性增加、疲劳和进行性认知衰退。在美国或欧洲出生的患有SCD的儿童中约90％将存活至成年期，但是与平均死亡年龄为约四十至五十岁的普通人群相比，他们的寿命缩短了二十至三十年。
技术实现思路
在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗血红蛋白病，诸如β-地中海贫血或镰状细胞病的方法和组合物。使用基因编辑技术以将遗传变化准确且高效地引入BCL11A基因的非编码红细胞谱系特异性增强子中，从而特异性下调红细胞前体中的BCL11A而不影响其他造血谱系。不受理论束缚，认为这种非编码变化将再激活γ-珠蛋白基因转录，并升高红细胞(RBC)中的胎儿血红蛋白(HbF)蛋白，从而改善疾病严重程度。因此，在一些方面，本公开提供了包含CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)的组合物，所述CD34+hHSPC在人B-细彪淋巴瘤11A(BCL11A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内具有遗传修饰。在一些实施方案中，所述组合物还包含无血清冷冻保存培养基、5％二甲亚砜(DMSO)、右旋糖酐-40或两种或更多种前述试剂的任何组合。在一些实施方案中，所述遗传修饰是或包含(至少一个)插入、缺失、突变或其组合。在一些实施方案中，所述遗传修饰包含由CRISPR-Cas9介导的修饰导致的插入和缺失(即，插入缺失(indel))。在一些实施方案中，遗传修饰通过向CD34+hHSPC递送Cas9内切核酸酶(例如，化脓性链球菌的内切核酸酶)(或编码Cas9核酸酶的核酸)和导向RNA(gRNA，诸如sgRNA)(或编码gRNA的核酸)而产生，所述导向RNA靶向人BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DHS。在一些实施方案中，所述gRNA包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2(SEQIDNO：1的修饰形式)。在一些实施方案中，所述gRNA在其5’端和3’端中的每一个处或其附近包含三个2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。在一些实施方案中，所述内切核酸酶包含N-末端SV40核定位信号(NLS)和/或C-末端SV40核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，Cas9和gRNA作为核糖核蛋白复合物递送，任选地其中所述gRNA与所述内切核酸酶的重量比为1∶1。在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出与未修饰的CD34+hHSPC相比γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加0.1至0.5，和/或其中修饰的CD34+hHSPC表现出与未修饰的CD34+hHSPC相比γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加0.2至0.6。在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出15％至50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。在一些实施方案中，遗传修饰的hHSPC或hHSPC群体表现出70％至90％的平均等位基因编辑频率。在一些实施方案中，在向受试者施用修饰的CD34+hHSPC之后，至少75％的修饰的CD34+hHSPC群体维持多谱系潜能至少十六周。在一些实施方案中，修饰的CD34+hHSPC群体表现出至少40％或至少80％的中靶插入缺失率。在一些实施方案中，修饰的CD34+hHSPC群体表现出小于5％或小于1％的脱靶插入缺失率。在其他方面，本公开提供了包括向患有血红蛋白病的受试者(例如，人受试者)施用(例如，通过注射/静脉内输注)一定剂量的CD34+hHSPC的方法，所述CD34+hHSPC在人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，其包含CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)，所述CD34+hHSPC在人B-细胞淋巴瘤11A(BCL11A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内包含遗传修饰。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171205 US 62/594,689;20180427 US 62/664,023;20181.一种组合物，其包含CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)，所述CD34+hHSPC在人B-细胞淋巴瘤11A(BCL11A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内包含遗传修饰。


2.如权利要求1所述的组合物，其还包含基本上不含血清、5％二甲亚砜(DMSO)和/或葡聚糖-40的冷冻保存培养基。


3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述遗传修饰包含插入缺失。


4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述遗传修饰通过向CD34+hHSPC递送Cas9内切核酸酶和靶向人BCL11A基因的+58DHS的导向RNA(gRNA)而产生。


5.如权利要求4所述的组合物，其中所述gRNA包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核苷酸序列。


6.如权利要求5所述的组合物，其中所述gRNA在其5’端和3’端中的每一个处或其附近包含三个2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。


7.如权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中所述Cas9内切核酸酶是化脓性链球菌Cas9内切核酸酶或其变体。


8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出0.1至0.5的γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加，和/或其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出0.2至0.6的γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加。


9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出15％至50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。


10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出70％至90％的平均等位基因编辑频率。


11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中在向受试者施用所述修饰的CD34+hHSPC之后，至少75％的所述修饰的CD34+hHSPC维持多谱系潜能至少十六周。


12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出至少40％的中靶插入缺失率。


13.如权利要求12所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出至少80％的中靶插入缺失率。


14.如权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出小于5％的脱靶插入缺失率。


15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述修饰的CD34+hHSPC表现出小于1％的脱靶插入缺失率。


16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其包含单剂量的所述修饰的CD34+hHSPC。


17.如权利要求16所述的组合物，其中所述单剂量包含至少至少2×106个修饰的CD34+hHSPC/kg。


18.如权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述遗传修饰通过向所述CD34+hHSPC递送包含N-末端SV40核定位信号(NLS)的化脓性链球菌Cas9内切核酸酶或其变体而产生。


19.如权利要求18所述的组合物，其中所述化脓性链球菌Cas9内切核酸酶或其变体还包含C-末端NLS，任选地C-末端SV40NLS。


20.如权利要求18或19所述的组合物，其还包含包含了SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核苷酸序列的gRNA(gRNA)。


21.如权利要求20所述的组合物，其中所述gRNA与所述内切核酸酶的重量比为1∶1。


22.一种方法，其包括向患有血红蛋白病的受试者施用一定剂量的CD34+人造血干细胞和祖细胞(hHSPC)，所述CD34+hHSPC在人B-细彪淋巴瘤11A(BCLl1A)基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内包含遗传修饰，其中所述hHSPC以有效量施用以相对于基线减少施用到所述受试者的输血次数和/或将所述受试者中的胎儿血红蛋白(HbF)水平增加到至少20％。


23.一种方法，其包括：
(a)动员患有血红蛋白病的受试者中的干细胞；
(b)在步骤(a)之后从所述受试者收集CD34+hHSPC；
(c)产生修饰的CD34+hHSPC，所述修饰的CD34+hHSPC在人BCL11A基因的红细胞谱系特异性增强子内的+58DNA酶I超敏位点(DHS)内包含遗传修饰；以及
(d)向所述受试者施用有效剂量的步骤(c)的所述修饰的CD34+hHSPC，以相对于基线减少施用到所述受试者的输血次数和/或将所述受试者中的胎儿血红蛋白(HbF)水平增加到至少20％。


24.如权利要求23所述的方法，其中步骤(a)包括向所述受试者施用CXCR4趋化因子受体的抑制剂，任选地其中所述CXCR4趋化因子受体的抑制剂为普乐沙福。


25.如权利要求23或24所述的方法，其中步骤(a)还包括向所述受试者施用粒细胞集落刺激因子。


26.如权利要求22-24中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用红细胞。


27.如权利要求26所述的方法，其中所述红细胞在步骤(a)之前和/或步骤(b)之后施用。


28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中收集至少15×106个CD34+hHSPC/kg。


29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用白消安。


30.如权利要求29所述的方法，其中所述白消安在步骤(c)之后且在步骤(d)之前施用。


31.如权利要求30所述的方法，其中每天静脉内施用4mg/kg至5mg/kg剂量的白消安，持续四天，或者每六小时静脉内施用0.5mg/kg至1mg/kg剂量的白消安，持续四天。


32.如权利要求30所述的方法，其中所述剂量基于药代动力学水平调整以实现4500μM/min至5500μM/min、优选5000μM/min的曲线下面积(AUC)。


33.如权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰是插入缺失。


34.如权利要求22-31中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰通过向所述CD34+hHSPC递送Cas9内切核酸酶和靶向人BCL11A基因的+58DHS的导向RNA(gRNA)而产生。


35.如权利要求34所述的方法，其中所述gRNA包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核苷酸序列。


36.如权利要求35所述的方法，其中所述gRNA在其5’端和3’端中的每一个处或其附近包含三个2’-O-甲基-硫代磷酸酯残基。


37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其中所述Cas9内切核酸酶是化脓性链球菌Cas9内切核酸酶。


38.如权利要求22-37中任一项所述的方法，其中中性粒细胞植入在所述受试者中在施用所述修饰的CD34+hHSPC后的35-45天内发生。


39.如权利要求38所述的方法，其中中性粒细胞植入在所述受试者中在施用所述修饰的CD34+hHSPC后的42天内发生。


40.如权利要求22-39中任一项所述的方法，其中所述血红蛋白病是β-地中海贫血。


41.如权利要求22-40中任一项所述的方法，其中相对于施用所述修饰的CD34+hHSPC之前的2年时间，所述受试者在施用所述修饰的CD34+hHSPC的2年时间内或在施用所述修饰的CD34+hHSPC之后的2年时间内需要更少的输血。


42.如权利要求22-41中任一项所述的方法，其中在施用所述修饰的CD34+hHSPC之后三个月开始，所述受试者实现输血减少或不需要输血达施用所述修饰的CD34+hHSPC之后至少三个月。


43.如权利要求22-42中任一项所述的方法，其中在施用所述修饰的CD34+hHSPC之后三个月开始，所述受试者实现输血减少或不需要输血达施用所述修...

【专利技术属性】
技术研发人员：E莫拉瓦，T查克拉博蒂，AS伦德伯格，T霍，L桑德勒，B尤斯塔斯，J罗瑟特，R考夫曼，
申请(专利权)人：沃泰克斯药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US