检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，尤其涉及检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。含有禽流感病毒RNA片段的待测物通过利用该引物和探针可通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术在等温条件下进行大量扩增，反应条件低，特异性好、灵敏度高，便于临床使用。

Combination of primers and probes, kit and detection method for detection of avian influenza virus

【技术实现步骤摘要】
检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
本专利技术涉及病毒检测
，尤其涉及检测禽流感病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法。
技术介绍
禽流感(Avianinfluenza，AI)是由禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)引起的禽类普遍易感的病毒性传染病，一直以来对我国的禽类养殖业造成巨大的经济损失。AIV为单股负链RNA病毒，有8个独立的RNA节段，亚型众多，最常见的病毒亚型为H5、H7、H9。AI分布广，世界各地均有分离出该病病原的报道，该病作为人畜共患病，不但给养禽业造成严重的危害，还对人类健康构成潜在威胁。AI的实验室诊断方法有很多，如通过观察鸡胚出血、发育迟缓等病变进行诊断，或者利用AIV血凝性进行血凝抑制实验，但特异性均不高。PCR体外核酸扩增具有好的特异性，然而传统PCR诊断方法需要高温退火、低温延伸等过程，核酸扩增反应条件高，实时荧光定量PCR还需要昂贵的仪器，使二者在临床推广使用中受到一定的限制。
技术实现思路
针对现有PCR诊断方法反应条件高的问题，本专利技术提供了用于检测禽流感病毒的引物和探针组合。以及，本专利技术还提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒。以及，本专利技术还提供了检测禽流感病毒的方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，所述引物的序列(如SEQIDNO.1～2所示)为：上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；所述探针的序列(如SEQIDNO.3所示)为：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。上述引物是根据禽流感保守基因(NP)序列经过人为设计而得，含有H5、H7、H9任一亚型的AIV均能够利用上述引物通过反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)在等温条件下进行大量扩增。其探针根据上述下游引物的序列经设计而得，探针上距离5′端30bp位置设有一个碱基缺口，并以四氢呋喃(THF)残基修饰(SEQIDNO.3中R即为THF)，当探针为单链时核酸内切酶不识别，只有当探针和上述引物扩增所得扩增产物中的目的片段结合后核酸内切酶才开始工作，从而可进一步提高该引物和探针组合的特异性，使其能够与其它禽常见呼吸道病毒(如新城疫病毒(DNV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等)核酸没有交叉反应，扩增后能够与其他禽类常见病毒进行区分，且检测限度为102拷贝/μL，灵敏度是PCR法(104拷贝/μL)灵敏度的100倍。用上述引物和探针组合进行等温核酸扩增的反应条件低，37℃左右、22min即可完成反应，反应条件低，不需昂贵仪器设备，使用水浴锅或体温加热均可，便于临床使用。以及，本专利技术实施例还提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒，包含上述引物和探针组合。使用该试剂盒进行禽流感病毒检测是反应条件低，操作简便，并具有特异性好、灵敏度高的优点。优选地，所述探针5′端以荧光基团修饰，3′进行磷酸化处理，所述下游引物的5′端以生物素修饰，扩增完成后可通过侧向流试纸条进行现场检测，从而能够简便、快捷地诊断禽流感病毒。优选地，所述试剂盒还包括基础缓冲液和乙酸镁。二者均可选择用于RT-RAA核酸扩增的市售试剂，如江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂。优选地，所述试剂盒还包括胶体金侧向流免疫层析试纸条(LFD)。LFD将RT-RAA和LFD进行结合，无需借助含有毒染料的传统琼脂糖电泳即可实现检测结果的可视化，扩增反应产物只需要滴加到试纸条上3min即可观察结果。即使在不具备恒温设备的条件下，该试剂盒借助人体的温度也可实现快速检测。该LFD优选杭州优思达生物科技公司的LFD。当选用该公司的LFD时，探针5′端是荧光基团应选用FAM荧光基团。以及，本专利技术实施例还提供了一种检测禽流感病毒的方法，具体操作为：提取待测物的基因组，用上述试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，扩增完成后用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条检测扩增产物。该方法用上述试剂盒可快速检测出H5、H7、H9亚型的AIV，反应条件低，特异性好，灵敏度高，适合临床兽医和基层实验室应用。优选地，所述重组酶介导等温扩增的反应体系为：反应温度为35～39℃，反应时间22～40min。该反应体系简单、反应条件参数少，易于操作和控制，能够在基层实验室使用，对试验条件要求低。优选地，所述反应时间为22～26min。优选地，用所述胶体金侧向流免疫层析试纸条进行扩增产物检测。将LFD与RT-RAA结合后构成的RT-RAA-LFD检测方法能够方面、快捷地检测出待测物中的AIV。附图说明图1为本专利技术实施例3～10中AIV的LFD试纸条检测结果；图2为本专利技术检验例1中特异性实验结果；图3为本专利技术检验例2中常规PCR检测AIV敏感性测试结果。图4为本专利技术检验例2中RT-RAA-LFD检测AIV敏感性测试结果。图5为本专利技术检验例2中RFQ-PCR检测AIV敏感性测试结果，其中0为阴性对照，1-7依次为100拷贝/μL-106拷贝/μL。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术实施例提供了用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，序列分别为：上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；探针：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。实施例2本专利技术实施例提供了一种检测禽流感病毒的试剂盒，具体包括：(1)等温扩增引物和探针：序列分别为：上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；下游引物：5′-Biotin-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；探针：5′-FAM-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THFCACAAAGGGCAATGA-P-3′。(2)基础缓冲液、乙酸镁(均为江苏奇天基因生物科技有限公司的RT-RAA核酸扩增试剂)。实施例3本专利技术实施例提供了一种检测禽流感病毒的方法，用实施例2的试剂盒进行操作。AIV(H5、H7、H9各亚型)为河北农业大学实验室保存。步骤具体如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物的序列为：/n上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；/n下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；/n所述探针的序列为：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测禽流感病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物的序列为：
上游引物：5′-ACAATGGTGATGGAACTGATTCGGATGATAAA-3′；
下游引物：5′-TCCCAGGATTTCTGCTCTCTCGCACTTGAT-3′；
所述探针的序列为：5′-AACATCCTCAAAGGGAAATTCCAAACAGCA-THF-CACAAAGGGCAATGA-3′。


2.一种检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物和探针组合。


3.根据权利要求2所述的检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针5′端以荧光基团修饰，3′进行磷酸化处理，所述下游引物的5′端以生物素修饰。


4.根据权利要求3所述的检测禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基础缓冲液和乙酸镁。

【专利技术属性】
技术研发人员：张铁，王文静，王春光，张鹏，翟向和，孟凡国，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13