一种EB病毒核酸定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种EB病毒核酸定量检测试剂盒。本发明专利技术设计了一组EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，序列如SEQ ID NO：1‑6所示；并进一步构建了检测试剂盒，包括磁珠法核酸提取试剂盒和EBV核酸扩增试剂盒。该试剂盒具有检测灵敏度高、重复性好、引物和探针保守性高、特异性强、覆盖EB病毒不同的亚型或变种、有利于提高EBV检测的准确性和特异性、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩増而导致的相互抑制和干扰等问题、能够高效的监控整个PCR扩増整个过程、避免出现假阴性结果等优点，核酸DMA提取方法简单，核酸纯度高，成本较低，而且操作简便快速、成本低廉，特别适用于EB病毒(EBV)精确的定量检测，可广泛的应用于生物医学临床诊断领域中。

A kit for quantitative detection of EBV nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
一种EB病毒核酸定量检测试剂盒
本专利技术属于生物医学及临床诊断
更具体地，涉及一种EB病毒(EBV)核酸定量检测试剂盒。
技术介绍
EB病毒(EBV)为疱疹病毒科，疱疹病毒Ⅳ型，是一种嗜人类淋巴细胞的疱疹病毒。EBV在人群中感染非常普遍，约90％以上的成人血清EBV抗体阳性。除原发性EBV感染可致传染性单核细胞增多症(infectiousmononucleosis，IM)外，EBV还引起慢性活动性EBV感染(chronicactiveEBVinfection，CAEBV)和EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(EBV-associatedHaemophagocyticlymphohistiocytosis，EBV-HLH)等非肿瘤性重症EBV相关疾病。EBV还是一种致肿瘤病毒，与许多肿瘤的发生相关，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，鼻咽癌(NPC)，胃癌和移植后淋巴细胞增殖症(PTLD)等。EBV原发感染后建立终身潜伏感染。EBV潜伏感染可分为四种类型：EBV潜伏感染0型，在健康的EBV既往感染个体，EBV在记忆性B细胞潜伏，只表达EBERs，这些个体称为健康携带者；潜伏感染Ⅰ型除EBERs外，EBV只表达EBNA1和BamHIA右侧片段(BARTs)，导致Burkitt’s淋巴瘤；潜伏感染Ⅱ型，EBV表达EBNA1、LMP1、LMP2、BART'S和EBERs，导致鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤；潜伏感染Ⅲ型，EBV表达所有的潜伏感染基因，导致免疫抑制病人的淋巴组织增生性疾病。针对不同的EBV感染相关疾病，选择适当的临床标本和实验室检测方法，对于EBV感染相关疾病的诊断和治疗十分重要。血清或血浆中EBV-DNA阳性提示患者体内存在活动性EBV感染或疾病与EBV密切相关(如原发EBV感染早期、EBV-HLH、大多数CAEBV、EBV相关肿瘤等)，需结合临床表现及其他检查结果综合分析判断；血清或血浆EBV-DNA阴性提示为血清阳性转化的EBV健康携带者、未感染过EBV的患者、非EBV相关疾病患者、以及部分EBV相关疾病患者，如部分IM患者及IM后期，极少数CAEBV患者(结合血清学判定)。外周血PBMC中EBV-DNA载量高于102.5拷贝/μgDNA是CAEBV的诊断标准之一。全血样本EBV-DNA载量主要用于免疫缺陷患者EBV感染的诊断，以提高诊断EBV感染的敏感性，不推荐用于有免疫力的患者。因血清EBV阳性转化的健康携带者每106个PBMC(外周血单核细胞)中大约有1～50个EBV感染的细胞，约7个拷贝(1～30个拷贝)EBV-DNA/106PBMC。因此，血清阳性转化的EBV健康携带者的全血或PBMC标本中可能检出低水平的EBV-DNA载量。因此，高灵敏性的EB病毒核酸特异定量检测技术非常重要。
技术实现思路
本专利技术旨在从根本上解决现有EB病毒(EBV)核酸定量PCR技术存在的灵敏度低、准确性差等问题，提供一种对EB病毒(EBV)检测灵敏度高、特异性强、稳定性重复性好的简便快速检测方法，适用于EB病毒(EBV)精确的定量检测。本专利技术的目的是提供一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合。本专利技术另一目的是提供一种EB病毒核酸定量检测试剂盒。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，包括如下组分，其序列如下：用于检测靶基因的探针为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3；用于扩增靶基因的下游引物为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3；用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。上述引物与探针组合在制备EB病毒检测产品方面的应用，以及含有所述引物与探针组合的EB病毒核酸定量检测试剂盒，应在本专利技术的包含范围之内。即本专利技术提供一种含有所述引物与探针组合的EB病毒核酸定量检测试剂盒。优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。更优选地：用于检测靶基因的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。另外，优选地所述试剂盒还包括EBV-PCR反应液、酶混合液、EBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述EBV-PCR反应液包括上述引物与探针组合和PCR缓冲液；所述PCR缓冲液组成为30mol/LpH8.3Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol/LKC1，4.5mmol/LMgCl2,0.15mol/LdNTPs；所述酶混合液包括热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份；所述阴性质控品为灭活阴性人源血浆，EBV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由EBV病毒血清样本稀释而成，浓度分别为5.0×105，5.0×104，5.0×103，5.0×102，1.0×102，1.0×105IU/ml，EBV病毒血清为灭活病毒血清样本。更优选地，所述试剂盒还包含内标，为人血DNA。内部为人基因组清蛋白基因的区域(Homosapiensalbumin(ALB),RefSeqGeneonchromosome4，NG_009291.1)。另外，本专利技术的EB病毒核酸定量检测试剂盒除了包括上述EBV核酸扩増试剂盒外，还包括磁珠法核酸提取试剂盒；所述磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液、洗脱液、磁珠液；所述裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5％，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍2-6.0mol/L，1-10mmol/LEDTA，所述EDTA的pH值为7.5；所述漂洗液组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/l00ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80％乙醇；所述洗脱液组成为含有10mmol/LTris-HCl，所述Tris-HCl的pH值为8.3，0.01-0.05％Prolin300；所述磁珠液组成为直径为1μm的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml；另外，优选地，本专利技术的EB病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，其特征在于：包括如下组分：/n用于检测靶基因的探针为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；/n用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；/n用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3；/n用于扩增靶基因的下游引物为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3；/n用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；/n用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。/n

【技术特征摘要】
1.一种EB病毒核酸定量检测引物与探针组合，其特征在于：包括如下组分：
用于检测靶基因的探针为：5’-AGCCACACGGGCCTCT-’3，其5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于内标检测的探针为：5’-ATGCCTGCTGACTTGCCTT-’3，其5’端标记为ROX荧光发生基团，3’端标记为MGB；
用于扩增靶基因的上游引物为：5’-TGGCAAAGATCTGCGTGGACA-’3；
用于扩增靶基因的下游引物为：5’-GCCAGCCTCAACTACGACT-’3；
用于扩增内标的上游引物为：5-CCCACTGCATTGCCGAA-’3；
用于扩增内标的下游引物为：5’-GCCCAGGAAGACATCCTT-’3。


2.权利要求1所述引物与探针组合在制备EB病毒检测产品方面的应用。


3.一种EB病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述引物与探针组合。


4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为5-20pmol。


5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：用于检测靶基因的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测内标的探针使用浓度为10pmol；所述用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为20pmol；所述用于检测内标的引物使用浓度为20pmol。


6.根据权利要求3-5任一所述试剂盒，其特征在于：还包括EBV-PCR反应液、酶混合液、EBV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；
所述EBV-PCR反应液包括权利要求1所述引物与探针组合和PCR缓冲液；
所述PCR缓冲液组成为30mol/LpH8.3Tris-HCl，10mmol/L(NH4)2SO4，30mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓文奡，葛毅媛，谢龙旭，翁丹容，邱美兰，
申请(专利权)人：广东凯普生物科技股份有限公司，广州凯普医药科技有限公司，潮州凯普生物化学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44