一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术制造技术

本专利属于医疗体外诊断领域，涉及一种新型冠状病毒2019‑nCoV核酸检测技术，步骤包括样品制备及RNA提取、反应体系配置和PCR扩增、质量控制和结果分析与判定。本专利操作简便、特异性强、准确度高且可重复性强，可在新型冠状病毒肺炎疑似病例确诊、解除隔离和出院标准判断过程中发挥重要作用。

Detection technology of a novel coronavirus 2019-nCoV nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术
本专利属于医疗体外诊断领域，涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，尤其是涉及一种操作简便、特异性强、准确度高且可重复性强的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术。
技术介绍
在2019-nCoV的防控过程中，快速检测试剂发挥了非常重要的作用。快速诊断试剂的灵敏性、特异性和稳定性对于2019-nCoV病例的早期发现、早期隔离和早期治疗具有非常重要的意义，也是目前控制病毒传染源最可靠的方法。快速诊断分抗原检测和抗体检测两类，抗原检测方法包括检测病毒表面抗原蛋白和检测特异核酸片段，用于确认体内是否存在病原体，适用于疾病潜伏期、急性期或病程初期。抗体检测一般用于判断病程进展程度或用于判断是否发生既往感染。兼具特异性、灵敏度、易操作、时间短等优势的聚合酶链式反应(PCR)、胶体金或荧光层析等技术是临床体外诊断常用的方法。新型冠状病毒2019-nCoV属于RNA病毒，其全基因序列早于2020年1月11日发布(由上海市公共卫生临床中心和公共卫生学院、华中科技大学武汉中心医院、武汉市疾控中心、中国疾控中心传染病预防控制所联合澳大利亚悉尼大学联合完成)，为反转录加实时聚合酶链式反应法(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)扩增病原体核酸(RNA)并实现新型冠状病毒2019-nCoV的快速检测提供了理论依据。其中，核酸序列、引物序列及探针的设计，以及多目标序列同步扩增或分步筛查确认的检测方式选择，是影响检测方法的灵敏度和准确性的关键因素。因此，开发一种操作简便、特异性强、准确度高且可重复性强的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术具有重要意义。
技术实现思路
本专利的有益之处在于，可以提供一种操作简便、特异性强、准确度高且可重复性强的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术。为实现上述功能，本专利涉及的一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，其特征在于，步骤如下：1)样品制备及RNA提取a.在生物安全柜内，取0.5mL溶液A，将咽拭子浸泡到溶液A中充分搅拌，并将棉拭子中的液体在管壁挤干净，盖上管盖，充分混匀，室温放置5min；b.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混匀，室温放置3min；c.12000rpm4℃离心10min，取上清液；d.将上清液加入1/2体积的溶液C，室温静置2min，并转移到核酸分离管；e.12000rpm4℃离心30s；f.将离心管中的液体倒掉后，在核酸分离管中加入洗液D500μL，8000rpm4℃离心1min；g.重复步骤f；h.倒掉离心管中的液体，12000rpm4℃离心2min，将核酸分离管甩干；i.将核酸分离管放到新的离心管，加入20-50μL的洗脱液E，静置2min，12000rpm离心1min；2)反应体系配置和PCR扩增j.取荧光定量反应液F、溶液G或内标溶液12μL，加入8μLRNA或阳性模板，直接进行荧光定量PCR反应；反应条件如下：第一步，1次，42℃持续10min；第二步，1次，95℃持续10s；第三步，40个循环，95℃持续5s，然后60℃持续34s；3)质量控制空白对照和阴性对照无扩增曲线或Ct＞40；阳性对照在相应的检测通道有S型扩增曲线；内标溶液在相应的检测通道有S型扩增曲线；4)结果分析与判定在检测有效的情况下，利用荧光定量反应液F、溶液G进行扩增的结果，CT值同时小于或等于37，判断为新冠状病毒核酸检测阳性；CT值同时大于或等于40，判断为新冠状病毒核酸检测阴性；37＜CT值＜40，需要重复试验，如果CT值＜40，判断为阳性，CT值≥40，判为阴性。最优地，溶液A为Trizol试剂，溶液B为三氯甲烷，溶液C为乙醇，洗液D为75％乙醇溶液，洗脱液E为TE，荧光定量反应液F为RNA反转录酶、DNA聚合酶、dNTP、引物、引物探针的混合溶液，溶液G为DEPC处理水。其中，引物和对应引物探针分为X和Z两种，引物X上游5`-gaccccaaaatcagcgaaat-3`、下游5`-tctggttactgccagttgaatctg-3`和探针5`-FAM-accccgcattacgtttggtggacc-TAMRA-3`，引物Z上游5`-ttacaaacattggccgcaaa-3`、下游5`-gcgcgacattccgaagaa-3`和探针5`-FAM-acaatttgcccccagcgcttcag-TAMRA-3`。具体实施方式为详细说明本专利的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施例予以说明：实施例一取咽拭子样本按步骤检测。1)样品制备及RNA提取a.在生物安全柜内，取0.5mL溶液A，将咽拭子浸泡到溶液A中充分搅拌，并将棉拭子中的液体在管壁挤干净，盖上管盖，充分混匀，室温放置5min；b.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混匀，室温放置3min；c.12000rpm4℃离心10min，取上清液；d.将上清液加入1/2体积的溶液C，室温静置2min，并转移到核酸分离管；e.12000rpm4℃离心30s；f.将离心管中的液体倒掉后，在核酸分离管中加入洗液D500μL，8000rpm4℃离心1min；g.重复步骤f；h.倒掉离心管中的液体，12000rpm4℃离心2min，将核酸分离管甩干；i.将核酸分离管放到新的离心管，加入20-50μL的洗脱液E，静置2min，12000rpm离心1min；2)反应体系配置和PCR扩增j.取荧光定量反应液F、溶液G或内标溶液12μL，加入8μLRNA或阳性模板，直接进行荧光定量PCR反应；反应条件如下：第一步，1次，42℃持续10min；第二步，1次，95℃持续10s；第三步，40个循环，95℃持续5s，然后60℃持续34s；3)质量控制空白对照和阴性对照无扩增曲线或Ct＞40；阳性对照在相应的检测通道有S型扩增曲线；内标溶液在相应的检测通道有S型扩增曲线；经检测，CT未显示，代表CT值同时大于或等于40，判断样本诊断结果为新冠状病毒核酸检测阴性。上述实施例仅供说明本专利之用，而并非是对本专利的限制；应当指出的是，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本专利构思范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，这些都属于本专利的保护范围；因此，凡跟本专利权利要求范围所做的均等变化与修饰，均应属于本专利权利要求的覆盖范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，其特征在于，步骤如下：/n1)样品制备及RNA提取/na.在生物安全柜内，取0.5mL溶液A，将咽拭子浸泡到溶液A中充分搅拌，并将棉拭子中的液体在管壁挤干净，盖上管盖，充分混匀，室温放置5min；/nb.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混匀，室温放置3min；/nc.12000rpm 4℃离心10min，取上清液；/nd.将上清液加入1/2体积的溶液C，室温静置2min，并转移到核酸分离管；/ne.12000rpm 4℃离心30s；/nf.将离心管中的液体倒掉后，在核酸分离管中加入洗液D 500μL，8000rpm 4℃离心1min；/ng.重复步骤f；/nh.倒掉离心管中的液体，12000rpm 4℃离心2min，将核酸分离管甩干；/ni.将核酸分离管放到新的离心管，加入20-50μL的洗脱液E，静置2min，12000rpm离心1min；/n2)反应体系配置和PCR扩增/nj.取荧光定量反应液F、溶液G或内标溶液12μL，加入8μL RNA或阳性模板，直接进行荧光定量PCR反应；反应条件如下：第一步，1次，42℃持续10min；第二步，1次，95℃持续10s；第三步，40个循环，95℃持续5s，然后60℃持续34s；/n3)质量控制/n空白对照和阴性对照无扩增曲线或Ct＞40；阳性对照在相应的检测通道有S型扩增曲线；内标溶液在相应的检测通道有S型扩增曲线；/n4)结果分析与判定/n在检测有效的情况下，利用荧光定量反应液F、溶液G进行扩增的结果，CT值同时小于或等于37，判断为新冠状病毒核酸检测阳性；CT值同时大于或等于40，判断为新冠状病毒核酸检测阴性；37＜CT值＜40，需要重复试验，如果CT值＜40，判断为阳性，CT值≥40，判为阴性。/n...

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测技术，其特征在于，步骤如下：
1)样品制备及RNA提取
a.在生物安全柜内，取0.5mL溶液A，将咽拭子浸泡到溶液A中充分搅拌，并将棉拭子中的液体在管壁挤干净，盖上管盖，充分混匀，室温放置5min；
b.在上述溶液中加入100μL的溶液B，充分混匀，室温放置3min；
c.12000rpm4℃离心10min，取上清液；
d.将上清液加入1/2体积的溶液C，室温静置2min，并转移到核酸分离管；
e.12000rpm4℃离心30s；
f.将离心管中的液体倒掉后，在核酸分离管中加入洗液D500μL，8000rpm4℃离心1min；
g.重复步骤f；
h.倒掉离心管中的液体，12000rpm4℃离心2min，将核酸分离管甩干；
i.将核酸分离管放到新的离心管，加入20-50μL的洗脱液E，静置2min，12000rpm离心1min；
2)反应体系配置和PCR扩增
j.取荧光定量反应液F、溶液G或内标溶液12μL，加入8μLRNA或阳性模板，直接进行荧光定量PCR反应；反应条件如下：第一步，1次，42℃持续10min；第二步，1次，95℃持续10s；第三步，40个循环，95℃持续5s，然后60℃持续34s；
3)质量控制
空白对照和阴性对...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兆增，富玉，高俊海，周慧，
申请(专利权)人：谱尼测试集团北京检验认证科学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11