异柠檬酸脱氢酶激酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了异柠檬酸脱氢酶激酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用，异柠檬酸脱氢酶激酶突变基因aceK序列用SEQ ID No.1所示。本发明专利技术构建的包含有大肠杆菌编码异柠檬酸脱氢酶激酶突变基因aceK的工程菌生物安全，遗传背景清晰，可以有效的提高大肠杆菌生产芳香族氨基酸的能力，苯丙氨酸和色氨酸的产量分别提高了12.1％和11.1％。

Isocitrate dehydrogenase kinase mutant and its application in the preparation of aromatic amino acids

【技术实现步骤摘要】
异柠檬酸脱氢酶激酶突变体及其在制备芳香族氨基酸中的应用
：本专利技术属于生物技术与分子生物学领域，具体地涉及一种大肠杆菌编码的异柠檬酸脱氢酶激酶突变基因aceK及该基因编码的氨基酸序列及其应用。
技术介绍
L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)又名L-苯基-α-氨基丙酸，为白色结晶粉末，有苦味，熔点为283℃，在自然界中广泛存在于卵、乳和动物蛋白中，其含量5为％～6％，在植物性蛋白质中约含1％。苯丙氨酸可溶于水，在水中的溶解度为3％，难溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，在100耐水中的溶解度为51℃：4.4g，等电点为5.48。苯丙氨酸有外消旋DL-型，L-型和D-型，其中最重要的是L-苯丙氨酸。苯丙氨酸是8种必须氨基酸之一，其作为营养物质的同时也是体内的生糖兼生酮氨基酸，在代谢中有着不可代替的作用。在工业上，L-苯丙氨酸主要用于与天冬氨酸反应形成人工甜味剂阿斯巴甜。这种甜味剂在功能食品添加剂中有着广泛的需求。在医药领域上，L-苯丙氨酸是静脉输液的必需物质，同时可以用作许多抗肿瘤药物靶向供给的载体。目前全球市场L-苯丙氨酸年需求量超过50000吨，并且逐年以15％的速率稳定增长，其中阿斯巴甜的年需求量约为20000吨；另一方面，医药行业每年L-苯丙氨酸需求量约为8000吨。因此，L-苯丙氨酸具有巨大的市场开发空间(LiuX,NiuH,LiQ,etal.Metabolicengineeringfortheproductionofl-phenylalanineinEscherichiacoli[J].3Biotech,2019,9(3).)。苯丙氨酸的制备方法有发酵法、酶法与化学合成法。用化学合成法经拆分可制得苯丙氨酸。化学合成法用苯甲醛和N-乙酞甘氨酸为原料，合成N-乙酞苯丙氨酸，再经氨基酞化酶拆分得L-苯丙氨酸。用氯节和丙二酸二乙醋或乙酞氨基丙二酸二乙醋或乙酞氨基氮基乙酸乙醋为原料，经氨基酞化酶水解制成L-苯丙氨酸和D-苯丙氨酸。国内生产厂家主要采用发酵法。苯丙氨酸的合成途径目前比较清晰，大肠杆菌利用自身的PTS系统将外源的葡萄糖转运至细胞内，同时将其磷酸化为六磷酸葡萄糖。磷酸化后的葡萄糖一部分通过糖酵解途径(EMP)进入三羧酸循环产生ATP为机体的生命活动提供能量和一些中间物质(作为前体物为参与机体其他物质的合成)，其中就包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，另一部分则进入磷酸戊糖非氧化还原途径(PP)产生赤藓糖4-磷酸(E4P)，PEP和E4P经过莽草酸途径生成分支酸并最终生成苯丙氨酸。苯丙氨酸的生物合成受其自身的反馈抑制和反馈阻遏。苯丙氨酸的生产菌株的代谢工程改造策略主要包括以下几部分内容：1.增加前体PEP和E4P的供给；2.增强莽草酸途径；3.降低其他芳香族氨基酸竞争途径通量；4.解除反馈阻遏和反馈抑制；5.增强苯丙氨酸外排；6.敲除苯丙氨酸去路途径。(RodriguezA,Martínez,JuanA,Flores,Noemí,etal.EngineeringEscherichiacolitooverproducearomaticaminoacidsandderivedcompounds[J].MicrobialCellFactories,2014,13(1):126.)目前很少有通过改造中央碳代谢TCA循环相关酶的活性进而有效提高苯丙氨酸产量的报道。异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶AceK(由aceK编码)处在两个中央代谢途径：TCA循环和乙醛酸循环之间的分支点的位置，它通过控制TCA循环中异柠檬酸脱氢酶(IDH)的活性来控制微生物体内代谢流在这两个代谢途径中的分布，具体表现为AceK通过磷酸化IDH并使其失活使其底物异柠檬酸转移到乙醛酸循环中。当生物需要TCA提供ATP时AceK通过使IDH去磷酸化重新激活该酶，回复其对异柠檬酸的强亲和力并重新提高TCA循环的通量。上述调控是由胞内的AMP诱导Acek的构象转换并决定AceK是激酶还是磷酸化酶。AceK作用于IDH活性位点的丝氨酸残基。目前尚未有大肠杆菌编码异柠檬酸脱氢酶激酶突变基因aceK用于选育芳香族氨基酸高产菌株的报道。
技术实现思路
本专利技术人在前期的工作中构建了一种大肠杆菌高产苯丙氨酸的高通量筛选方法，通过对一株苯丙氨酸菌株进行诱变后筛选获得一株苯丙氨酸产量提升的突变菌，再挖掘分析其中对苯丙氨酸高产相关的突变基因，并做了进一步研究，最终完成本专利技术。本专利技术提供一种异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体，其氨基酸序列在如SEQIDNO：1所示氨基酸序列存在下述突变：第26位氨基酸突变为K。本专利技术进一步提供编码如上述异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体的编码基因。更具体地，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术尤其提供异柠檬酸脱氢酶激酶编码基因在制备芳香族氨基酸中的应用。在一个具体实施方式中，其是通过含有所述异柠檬酸脱氢酶激酶导入大肠杆菌生产芳香族氨基酸的工程菌的基因组中。其中，所述异柠檬酸脱氢酶激酶编码基因优选编码具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示氨基酸序列的多肽。更优选地，所述异柠檬酸脱氢酶激酶编码基因具有SEQIDNO：3所示核苷酸序列。本专利技术构建的包含有大肠杆菌编码异柠檬酸脱氢酶激酶突变基因aceK的工程菌生物安全，遗传背景清晰，可以有效的提高大肠杆菌生产苯丙氨酸等芳香族氨基酸的能力，在摇瓶水平可提高苯丙氨酸积累水平达12.1％以上，可提高色氨酸积累水平11.1％以上。附图说明图1为用于基因组编辑的质粒pCas-aceK的图谱。图2为大肠杆菌苯丙氨酸工程菌株HDH5和HDH5-k和为色氨酸工程菌株Kw002和Kw002-k摇瓶水平发酵验证结果。具体实施方式本专利技术人在前期的工作中专利技术了一种基于苯丙氨酸的高通量的筛选方法，并利用该方法筛选出多株比出发菌的苯丙氨酸产量不同程度上提高的突变株(Liu,Y.,Zhuang,Y.,Ding,D.,Xu,Y.,Sun,J.,andZhang,D.(2017)Biosensor-BasedEvolutionandElucidationofaBiosyntheticPathwayinEscherichiacoli,ACSsyntheticbiology，2017May19；6(5):837-848.doi:10.1021/acssynbio.6b00328.)，该苯丙氨酸高产菌株的基因组测序结果已经公开发表。测序后发现aceK基因的突变型E26K对苯丙氨酸产量提高具有重要作用。将该突变引入本实验保存的一株大肠杆菌高产色氨酸工程菌株中发现在摇瓶水平也可显著提升色氨酸发酵产量。本专利中提及的苯丙氨酸菌株HDH5菌株和Kw002菌株的背景及相关操作已在发表的论文中详细说明(Liu,Y.,Zhuang,Y.,Ding,D.,Xu,Y.,Sun,J.,andZhang,D.Biosensor-BasedEvolutionandElucidationofaBiosyntheticPathwayinEscherichiac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列存在下述突变：第26位氨基酸突变为K。/n

【技术特征摘要】
1.一种异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列在如SEQIDNO：1所示氨基酸序列存在下述突变：第26位氨基酸突变为K。


2.如权利要求1所述的异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。


3.编码如权利要求1或2所述异柠檬酸脱氢酶激酶的突变体的编码基因。


4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，刘永飞，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12