一种催化性能提高的脂肪酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体公开了一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术提供一种热稳定性提高的脂肪酶CALB突变体A146G‑L278M和A146G‑L278M‑A151P的基因及酯合成应用。本发明专利技术在野生型脂肪酶基因序列的基础上，进行理性设计选择合适的突变位点，最终获得了T

Lipase with improved catalytic performance and its application

【技术实现步骤摘要】
一种催化性能提高的脂肪酶及其应用
本专利技术涉及一种催化性能提高的脂肪酶及其应用，具体涉及一种最适反应温度、活性和热稳定性提高的脂肪酶及其应用，属于基因工程

技术介绍
脂肪酶具有良好的水解、转酯、酯化、酯交换等反应的催化能力，在食品、医药、精细化工、生物能源等行业中应用广泛。微生物来源的脂肪酶已成为工业应用中脂肪酶的主要来源。工业中的催化反应一般在较高的温度下进行，一方面是增加温度能提高酶反应速率，另一方面是由于温度的升高可以提高反应物的溶解度并减少微生物污染的风险。此外，也可减少冷却设备的使用，从而节约生产成本。但是自然界中天然的微生物脂肪酶在高温下极易失活，限制了脂肪酶在工业中的应用。因此，获得最适温度提高、热稳定性强、催化活性高的脂肪酶对于工业应用具有重要意义。南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)来源于南极假丝酵母(Candidaantarctica)，CALB由于具有出色的酯合成、水解、转酯等催化活性，广泛应用于工业。但天然来源的CALB耐热性较差，较高温度下催化活力低，很大程度上制约了CALB在工业中的应用。因此提高CALB的最适反应温度、耐热性及催化活性对拓宽CALB的工业应用具有重要意义。提高脂肪酶的催化特性的途径主要有两个，一是从自然界中筛选获得，二是对现有的酶进行分子改造。其中，酶的分子改造主要有两个途径，一是定向进化，二是理性设计。通过以上方法可以提高酶的一种或者两种特性，但是能够同时提高酶的多种催化特性的报道较少，如同时提高最适反应温度、耐热性及催化活性。Xie等人通过选取活性部位附近高B-factor值的柔性位点进行突变，成功得到南极假丝酵母脂肪酶B的优势双突变体D223G/L278M，其在48℃下的半衰期为49min，为野生型的13倍；孵育15min的半失活温度(T5015)为58.5℃，较野生型提高了12℃；Tm值较野生型增加了3.6℃；最适温度比野生型提高了6.5℃；催化效率(kcat/Km)比起野生型，无显著变化，均为38.4min-1μM-1。对于单突变体L278M，其在48℃下的半衰期比野生型提高了6.4倍，催化效率(kcat/Km)较野生型提高了40％，最适反应温度提高了2.5℃。(参考文献：Xie,Y.,An,J.,Yang,G.,Wu,G.,Zhang,Y.,Cui,L.,Feng,Y.,2014.Enhancedenzymekineticstabilitybyincreasingrigiditywithintheactivesite.TheJournalofbiologicalchemistry.289,7994-8006.)。此外，谢渊等人还成功获得了催化效率较野生型分别提高26倍和33倍的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A281F和I285F。通过进一步组合突变成功获得热稳定性和催化效率均有所提高的三点突变体D223G/L278M/A281F，酶的热稳定性及催化效率较野生型分别有6.5倍和10倍的提升，但其最适反应温度情况并无报道(谢渊,脂肪酶活性中心区域进化提高酶动力学稳定性和催化活性.吉林大学,2014.)。Zhang等人采用定向进化策略来筛选热稳定性有所提高的突变体，经两轮易错PCR分别得到两株热稳定性有所提高的突变体23G5(V210I/A281E)和195F1(V210I/A281E/V221D)，比起野生型，突变体23G5和195F1在70℃的半衰期增加了约20倍；对于底物p-NB，突变体23G5和195F1的催化效率(kcat/Km)分别比野生型高4.4和3.3倍(参考文献：Zhang,N.,Suen,W.C.,Windsor,W.,Xiao,L.,Madison,V.,Zaks,A.,2003.ImprovingtoleranceofCandidaantarcticalipaseBtowardsirreversiblethermalinactivationthroughdirectedevolution.ProteinEngineering,DesignandSelection.16,599-605.)。Kim等人依据结合B-factor值和RosettaDesign算法进行氨基酸残基位点的选择，成功获得热稳定性有所提高的南极假丝酵母脂肪酶B的两个突变体K13L、R249L。尤其是R249L，其在55℃孵育1h后的残余酶活比野生型高2倍，比起野生型Tm值增加了2.3℃。动力学研究结果表明，与野生型相比，突变体R249L和野生型的Vmax/Km分别为0.048s-1和0.052s-1，说明突变后催化活性没有太大变化(参考文献：Kim,H.S.,Le,Q.A.T.,Kim,Y.H.,2010.DevelopmentofthermostablelipaseBfromCandidaantarctica(CalB)throughinsilicodesignemployingB-factorandRosettaDesign.EnzymeandMicrobialTechnology.47,1-5.)。Park等人通过分子动力学模拟结合RosettaDesign算法选择合适的氨基酸残基位点，成功获得了热稳定性提高的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A251E，A251E在50℃下的半衰期(251min)是野生型(100min)的2.5倍。但是比起野生型，突变体A251E的比活下降了一半(参考文献：Park,H.J.,Park,K.,Kim,Y.H.,Yoo,Y.J.,2014.ComputationalapproachfordesigningthermostableCandidaantarcticalipaseBbymoleculardynamicssimulation.JournalofBiotechnology.192,66-70.)。Le等人采用计算机工具MODIP和DbDv1.20预测CALB潜在的二硫键形成位点，最终成功获得热稳定性提高的南极假丝酵母脂肪酶B突变体A162C-K308C。突变体A162C-K308C的酶液在50℃孵育1h后，其残余酶活是野生型的1.5倍。突变体A162C-K308C在50℃的半衰期(220min)比野生型(49min)提高了约4.5倍。比起野生型Tm值增加了1.1℃。突变体R249L和野生型的Vmax/Km分别为0.851s-1和0.936s-1，突变后催化效率有轻微的下降(参考文献：Le,Q.A.T.,Joo,J.C.,Yoo,Y.J.,Kim,Y.H.,2011.DevelopmentofthermostableCandidaantarcticalipaseBthroughnovelinsilicodesignofdisulfidebridge.BiotechnologyandBioengineering.109,867-876.)。Chodorge等人建立的一个理性定向策略，筛选得到一株热稳定性有所提高的突变体35E3(N317Y)，该突变体在90℃孵育15min后，其残余酶活是野生型的7.5倍。而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列是(1)或(2)：/n(1)SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；/n(2)在SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的基础上，经修饰、缺失或添加一或多个氨基酸获得的同源性90％及以上的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列是(1)或(2)：
(1)SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列；
(2)在SEQIDNO.3或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列的基础上，经修饰、缺失或添加一或多个氨基酸获得的同源性90％及以上的氨基酸序列。


2.编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因。


3.含权利要求2所述基因的载体。


4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包括pPICZαA。


5.表达权利要求1所述脂肪酶突变体的细胞。


6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞的宿主包括毕赤酵母。


7.一种同时提高脂肪酶的最适反应温度、活性和热稳...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻晓蔚，徐岩，温露文，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32