本发明专利技术涉及用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，酶氨基酸序列(Chitinolytic bacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变，由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M，其有意效果在于，改进的几丁质酶生产乙酰氨基葡萄糖的酶活较野生型酶提高10.07‑34.90％。
Efficient chitinase for the production of acetylglucosamine
【技术实现步骤摘要】
用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及乙酰氨基葡萄糖生产用高效几丁质酶的制备。
技术介绍
几丁质(chitin)也称为甲壳质，是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的直链高分子生物多聚体，是含量仅次于纤维素的第二大天然多聚物。几丁质是甲壳类动物、昆虫、真菌及线虫等病原生物体壁结构上的重要组成，对机体具有支持与保护作用。几丁质酶(Chitinase)EC3.2.1.14是BENECKEU在1905年研究几丁质芽孢杆菌分解几丁质的过程中，首次分离发现的，可彻底水解几丁质为N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，几丁质酶广泛分布于真菌、细菌及放线菌等，还大量存在于昆虫、甲壳动物、高等植物甚至病毒中。几丁质酶是生物体内降解或利用几丁质的关键，几丁质酶能通过水解病原真菌细胞壁，破坏害虫体壁及杀虫增效等机制发挥生物防治作用，另一方面几丁质酶还能通过催化几丁质水解，促进自然界循环的作用，维持生态系统平衡。几丁质酶催化几丁质水解成N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或GlcNAc具有抗菌、调节机体免疫，抑制肿瘤细胞生长，使几丁质酶被大量用于环境保护、医药、农业、食品加工等领域并表现出巨大的市场潜力。继BENECKEU于1905年首次从几丁质芽孢杆菌(Bacilluschitinovrous)中发现并分离微生物几丁质酶后，各国学者陆续发现细菌、放线菌、真菌、甚至病毒等分属46个属近70个种的微生物均能分泌几丁质酶。此外，海洋微生物也蕴藏着巨大的潜力，诸如珊瑚、嗜冷菌(Moritellamarina)、海洋链霉菌(Streptomycesolivaceus)、白孢链霉菌(Streptomycesalbosporeus)及蜂房芽孢杆菌(Bacilluspluton)等海洋微生物都表现出极强的几丁质酶分泌能力，而芽孢杆菌属(Bacillussp.)中的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等更是目前研究运用比较多的几丁质酶来源微生物，ChenJ-K等从AeromonashydrophilaH-2330中提取的粗酶从甲壳素生成GlcNAc的产率是77％，AleiZhang从ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBC-H1中克隆获得了一种新的几丁质酶，具有外作用、内作用和N-乙酰-β-d-葡萄糖胺酶的活性，其对胶体几丁质的活性为15.3U/mg，本研究在其基础上，提高了N-乙酰-β-d-葡萄糖胺酶的活性。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术的目的在于提供具有更高活性的几丁质酶。本专利技术的制备过程如下：1.从NCBI上获得几丁质酶序列(Chitinolyticbactermeiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GCTCGAATTCGGATCATGTCGCAAATCAATCGCT，R:GAATTAATTCGGATCTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2.质粒DNA的提取将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3.易错PCR扩增与突变文库的构建以步骤二获得的质粒为模板，用NcoⅠ酶切使质粒线性化，设计引物CmChi1-F：ATTCCGATATCCATGATGTCGCAAATCAATCGCT和CmChi-R:CCGGCGATGGCCATGTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，Mn2+浓度0.5mmol/l，Mg2+浓度为7.0mmol/l，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用NcoⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliBL21，涂布于固体LB平板(100μg/mlAmp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；4.突变文库的高通量筛选从LB平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μlLB培养基(内含50μg/mlAmp)的96孔中，每孔对应一特定转化子，每块96孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照，37℃、200r/min振荡培养12h，在无菌条件下，从96孔板中取出20μl菌液，4℃临时冷藏种子于96深孔板，25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后，以每孔一一对应为原则，移取10μl菌液，对应涂布于以几丁质为唯一碳源的选择性固体培养基，35℃培养5d后，将比对照组透明圈大的克隆挑出并进行复筛；5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；6.突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的E.coliBL21发酵培养；7.突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；8.对突变体进行SDS-PAGE电泳；9.采用Bradford测定蛋白质浓度。本专利技术的有益效果是：获得了更高活性的N-乙酰-β-d-葡萄糖胺酶。附图说明图1几丁质酶SDS-PAGE电泳图图2野生型几丁质酶及突变位点三维图具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。实施例1本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；表1实验材料和试剂表2实验仪器设备AB104-N电子分析天平梅特勒-托利多上海有限公本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变，由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M，构建方法包括以下步骤：/n1)从NCBI上获得几丁质酶序列(Chitinolyticbacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GCTCGAATTCGGATCATGTCGCAAATCAATCGCT，R:GAATTAATTCGGATCTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，PCR反应结束后，加20μl Cloning Enhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coli JM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coli BL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；/n2)质粒DNA的提取/n将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coli BL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；/n3)易错PCR扩增与突变文库的构建/n以步骤二获得的质粒为模板，用Nco Ⅰ酶切使质粒线性化，设计引物CmChi1-F：ATTCCGATATCCATGATGTCGCAAATCAATCGCT和CmChi-R:CCGGCGATGGCCATGTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRa Taq Buffer，dNTPs Mixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA 200ng，Taq DNA聚合酶2.5U，PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，Mn...
【技术特征摘要】
1.用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Chitinolyticbactermeiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变，由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得几丁质酶序列(Chitinolyticbactermeiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)，交生物公司合成，采用HindⅢ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GCTCGAATTCGGATCATGTCGCAAATCAATCGCT，R:GAATTAATTCGGATCTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用HindⅢ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒为模板，用NcoⅠ酶切使质粒线性化，设计引物CmChi1-F：ATTCCGATATCCATGATGTCGCAAATCAATCGCT和CmChi-R:CCGGCGATGGCCATGTTACTTGTTCATGTTGCCCAT，进行易错PCR扩增基...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪利平，
申请(专利权)人：汪利平，
类型：发明
国别省市：广东;44
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