LDLR基因缺失斑马鱼的制备制造技术

本发明专利技术利用CRISPR/Cas9技术，构建成了LDLR基因缺失斑马鱼，具体步骤包括：1)根据LDLR基因序列，确定LDLR靶位点；2)制备gRNA；3)体外转录Cas9mR NA；4)将Cas9mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；5)将F0胚胎饲养至性成熟；6)与野生型成鱼外交，筛选F0；7)选取可产生有效突变的F0自交，筛选F1；8)从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；9)筛选L DLR基因敲除纯合子即为稳定遗传的LDLR基因缺失斑马鱼。本发明专利技术构建的LDLR基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于血管栓塞的研究。究。究。

【技术实现步骤摘要】
LDLR基因缺失斑马鱼的制备


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及LDLR基因缺失斑马鱼的制备。

技术介绍

[0002]心血管疾病的死亡率极高，已成为人类疾病致死的第一重要原因，其中最主要的一个病理根本就是动脉粥样硬化，是多种因素促成，一般是由大中动脉血管内壁免疫细胞浸润，胆固醇、类脂肪等脂类物质在血管壁粘附，出现脂质条纹、脂核、钙质沉着和纤维等组织增生，最后形成血肿破裂、大块出血、血栓等，导致一系列的脂肪代谢紊乱、神经血管功能失调、官腔狭窄、动脉弹性减低等。
[0003]LDLR即是低密度脂蛋白受体，也是肝细胞表面受体之一，能够结合Apoe，从而清除血中的脂蛋白颗粒，同时LDLR也能通过与LDL颗粒上的脂蛋白B相互作用，从而清除血中的LDL，LDLR对清除血液中胆固醇和甘油三酯富集的脂蛋白颗粒非常重要。
[0004]斑马鱼是除了大鼠和小鼠以外，第三大脊椎动物模型，斑马鱼体外受精、体外发育、胚胎透明、发育过程可视、一次产卵数量大，是研究心血管疾病良好的动物模型。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是利用CRISPR/Cas9系统构建一种LDLR基因缺失斑马鱼。
[0006]本专利技术的制备过程如下：
[0007]本专利技术靶位点DNA序列为：5
’‑
GGTAGCTGGAAGTGTGATGG
‑3’
。
[0008]本专利技术提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5
’‑<br/>TAGGTAGCTGGAAGTGTGATGG
‑3’
，5
’‑
AAACCCATCACACTTCCAGCTA
‑3’
，使用该试剂盒可以用于LDLR基因表达的沉默。
[0009]本专利技术提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的Oligo片段识别目的基因的靶位点，与Cas9结合并识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。
[0010]进一步的，所述靶点为一个或以上。
[0011]进一步的，本专利技术提供LDLR基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：
[0012]1.根据LDLR基因序列，确定LDLR靶位点；
[0013]2.根据LDLR靶位点，设计Oligo序列；
[0014]3.构建gRNA体外转录载体；
[0015]4.PCR获得gRNA体外转录模板；
[0016]5.对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；
[0017]6.制备Cas9 mRNA的体外转录模板；
[0018]7.体外转录Cas9 mRNA；
[0019]8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；
[0020]9.将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；
[0021]10.将F0胚胎饲养至性成熟；
[0022]11.与野生型成鱼外交，筛选F0；
[0023]12.选取可产生有效突变的F0自交，筛选F1；
[0024]13.从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代；
[0025]14.筛选LDLR基因敲除纯合子即为稳定遗传的LDLR基因缺失斑马鱼。
[0026]本专利技术的有益效果和优点在于：
[0027]本专利技术构建的LDLR基因缺失斑马鱼为国内外首例。
[0028]本专利技术构建的LDLR基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于血管栓塞的研究。
附图说明
[0029]图1：克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ电泳图
[0030]图2：菌液PCR鉴定
[0031]图3：gRNA体外转录模板
[0032]图4：体外转录Cas9 mRNA
[0033]图5：PCR、酶切鉴定突变体
[0034]图6：CYP1B1基因缺失斑马鱼与野生型序列对比
具体实施方式
[0035]下面通过实施例对本专利技术做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。
[0036]实施例1：本专利技术动物模型的制备
[0037]1.实验动物
[0038]按标准化方案养殖野生型斑马鱼(TU品系)，水温28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液，以受精的小时数(hours post fertilization，hpf)或受精的天数(days post fertilization，dpf)表示胚胎和幼鱼的发育阶段。
[0039]2.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
[0040]在NCBI上查询斑马鱼LDLR基因序列，根据CRISPR/Cas9敲除原理，在http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx上设计LDLR靶位点，靶位点包含20个碱基，靶点的选择标准为：5
’‑
GG
‑
(N)18
‑
NGG
‑3’
；其中5
’
端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，靶位点3
’
端是NGG。
[0041]3.构建gRNA体外转录载体
[0042]3.1用BbsⅠ酶切pT7
‑
gRNA、切胶回收(见图1)，得到gRNA克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ，酶切体系如下表1：
[0043]表1酶切体系：
[0044][0045]3.2根据靶位点订购两条oligo，oligo1序列为5
’‑
TAGGTAGCTGGAAGTGTGATGG
‑3’
，oligo2序列为5
’‑
AAACCCATCACACTTCCAGCTA
‑3’
；
[0046]3.3用ddH2O分别将oligo溶解为10μM的溶液，退火，得到粘性末端小片段，退火程序见表2；
[0047]表2退火程序
[0048][0049]3.4将退火后的片段与回收的上述gRNA克隆骨架pT7
‑
gRNA
‑
BbsⅠ连接、转化，挑取克隆，用RV
‑
M与Oligo2作为引物进行菌液PCR鉴定(58℃退火，延伸30sec，30cycle)，目的条带约为130bp(见图2)，挑取阳性克隆送去测序，选取序列正确的克隆甘油保菌、提质粒，RV
‑
M序列：5
’‑
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA
‑3’
，连接体系见表3；
[0050]表3连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LDLR基因缺失斑马鱼的制备，其特征在于，包括以下步骤：1)根据LDLR基因序列，确定LDLR靶位点；2)根据LDLR靶位点，设计Oligo序列；3)构建gRNA体外转录载体；4)PCR获得gRNA体外转录模板；5)对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；6)制备Cas9 mRNA的体外转录模板；7)体外转录Cas9 mRN
A
；8)添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；9)...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪利平，
申请(专利权)人：汪利平，
类型：发明
国别省市：