【技术实现步骤摘要】
用于降低啤酒非生物性浑浊的热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶的制备。
技术介绍
狭义的β-葡聚糖酶特指内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC.3.2.1.73)，其底物为内切β-1,3和内切β-1,4混和键连接的内切β-D-葡萄糖，主要分解大麦中的β-葡聚糖和细菌地衣多糖。β-葡聚糖主要分布于植物和微生物中，在大麦、燕麦、高粱、大米和小麦等谷物的胚乳细胞壁中的含量尤其丰富，β-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子形式溶于水，形成的溶液黏度较高，给工业生产带来诸多问题，如大麦中高含量的β-葡聚糖(4.0-8.0％)可造成麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，并可引起啤酒的非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。绝大多数微生物来源的酶系对大麦β-葡聚糖无特异性，而能特异分解大麦β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源芽孢杆菌、瘤胃微生物和少数真菌。热稳定性差是当前β-葡聚糖酶在工业应用中普遍存在的问题，有通过酶的固定化、添加保护剂和...
【技术保护点】
1.用于降低啤酒非生物性浑浊的热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Beta-1,3-1,4-glucanase,GenBank:AFD54461.1)在第158位、第160位、第253位上发生突变，由原来的A、S、S分别突变为R、P、G，构建方法包括以下步骤：/n1)从NCBI上获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶序列(Beta-1,3-1,4-glucanase,GenBank:AFD54461.1)，交生物公司合成，采用EcoRⅠ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GACGGAGCTCGAATTGCAGAGCATTAACTTCAT，...
【技术特征摘要】
1.用于降低啤酒非生物性浑浊的热稳定性β-1,3-1,4-葡聚糖酶，其特征在于，所述酶氨基酸序列(Beta-1,3-1,4-glucanase,GenBank:AFD54461.1)在第158位、第160位、第253位上发生突变，由原来的A、S、S分别突变为R、P、G，构建方法包括以下步骤：
1)从NCBI上获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶序列(Beta-1,3-1,4-glucanase,GenBank:AFD54461.1)，交生物公司合成，采用EcoRⅠ酶切pET20b(+)质粒，设计PCR引物F:GACGGAGCTCGAATTGCAGAGCATTAACTTCAT，R:ATTCGGATCCGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，PCR反应结束后，加20μlCloningEnhancer到PCR体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pET20b(+)质粒用EcoRⅠ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的PCR产物与纯化的线性载体混合均匀，加入In-Fusion酶，50℃反应15min，转化E.coliJM109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主E.coliBL21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
2)质粒DNA的提取
将携带有质粒pET20b(+)/CmChi1的E.coliBL21基因工程菌接种于LB/Amp(Amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
3)易错PCR扩增与突变文库的构建
以步骤二获得的质粒为模板，用NotⅠ酶切使质粒线性化，设计引物CmChi1-F：CAAGCTTGTCGACGGGACGGAGCTCGAATTGCAGA和CmChi-R:TCGGATCCGAATTCGTTCGGATCCGAATTTTTTTTTTTTT，进行易错PCR扩增基因，易错PCR扩增体系(50μl)为10×TaKaRaTaqBuffer，dNTPsMixture，引物各0.2μmol/L，模板DNA200ng，TaqDNA聚合酶2.5U，5mmol/lMn2+，0.5U/μl的TaqDNA聚合酶2.5μl，7mmol/l的Mg2+,PCR反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10m...
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