基因敲除方法技术

提供一种供体构建体，以及基因敲除方法及其系统和试剂盒。所述体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA。所述基因敲除方法利用供体构建体中包含的标记物基因富集被基因敲除的细胞，提高通过序列特异性核酸酶产生基因敲除的效率。

Gene knockout method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因敲除方法
本专利技术涉及基因编辑技术，具体涉及基因敲除方法。
技术介绍
基因编辑技术彻底改变了对基因功能的实验研究。三种主要的技术，ZFN(锌指核酸酶)[1]，TALENs(转录激活物样效应子核酸酶)[2-4]和CRISPR/Cas9系统[5-7]，使用不同的机制产生序列特异性双链断裂(double-strand breaks,DSBs)并随后引发天然修复系统完成序列特异性修饰[8,9]。这些技术在功能基因研究[10]、染色体位点的动态和实时成像[11,12]、疾病突变的校正[13]、基因治疗[14]等方面具有广泛的应用。CRISPR/Cas9系统因其高效性和易于操作，变得特别受欢迎。CRISPR/Cas9系统原本被细菌免疫系统用来抵御外源病毒或质粒，在II类CRISPR系统中，Cas9核酸内切酶在sgRNA的引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生修复错误(碱基的缺失或插入)，从而产生基因编辑的效果。虽然CRISPR/Cas9系统在基于设计的和序列特异性的基因组研究中具有前所有未有的优势，但CRISPR/Cas9系统引发的基因编辑在细胞群体中仍然属于稀有事件，要得到真正的基因被编辑的单克隆，需要进行繁琐的劳动，因此该系统在技术上仍然具有挑战性，即使是对于在哺乳动物细胞中产生基因敲除这样的简单任务来说[15]。已进行了各种努力来提高产生基因敲除的方案的效率，例如整合CRISPR/Cas9系统以永久表达Cas9和sgRNA[16]、预先产生稳定表达Cas9的细胞系[17]、增强非同源末端连接(NHEJ)途径[18]、通过同时破坏能实现特异性药物选择的单独基因来富集基因-靶向事件[19]、以及使用代理报告子(surrogate reporter)富集基因敲除[20,21]。但是，各种缺点限制了这些技术的广泛应用。特别是，在哺乳动物细胞中产生多基因敲除仍然是难以完成的任务。当使用传统方法时，即使是敲除单个基因有时也是长时间的，繁重的和高风险的任务[22]，因为它们缺乏对含有靶基因修饰的稀少克隆的有效富集。如果靶基因的破坏可以导致能够用于富集的表型变化，可以容易地获得基因敲除克隆，例如Hela CSPG4-/-细胞赋予了对艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素B的抗性[23]。但是，该策略无法通用。传统方法是要共转染表达抗生素抗性或荧光蛋白的质粒[23,24]，但是这种方法不会富集含有靶向修饰的少量细胞。已报道，外源dsDNA片段可能通过不同的修复机制被整合到具有DSBs的染色体位点上。通过同源重组(HR)修复需要构建长侧翼序列，整合效率较低，而通过非同源末端连接(Non-Homologous end joing,NHEJ)DNA修复的整合效率[27,28]通常高于同源重组修复[29]。已有研究使用CRISPR/Cas引发的NHEJ介导外源线性供体DNA的插入，以达到基因敲入的目的[30-34]。
技术实现思路
本专利技术提供供体构建体，以及基因敲除方法及其系统和试剂盒。本专利技术的基因敲除方法利用所述供体构建体中包含的标记物基因富集被基因敲除的细胞，提高通过序列特异性核酸酶产生基因敲除的效率。根据本专利技术的一个方面，提供供体构建体，所述供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA，所述线性供体DNA由中间向两端依次包含：表达盒；位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的靶序列，所述靶序列含有可被所述序列特异性核酸酶切割的靶位点；位于两端的保护序列；其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因。在本专利技术中，所述线性供体DNA是双链线性供体DNA。在优选的实施方案中，所述供体构建体是线性供体DNA。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在另一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。在另一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是Cas9核酸酶。在另一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是NgAgo核酸酶。在一些实施方案中，所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有靶序列。在一些实施方案中，所述线性供体DNA在两端分别具有靶序列。在一些实施方案中，所述线性供体DNA中两端的靶序列相同。在一些实施方案中，所述线性供体DNA中两端的靶序列不同。在进一步的实施方案中，所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于相同的基因。在其它进一步的实施方案中，所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于不同的基因。在优选的实施方案中，所述标记物基因是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。在优选的实施方案中，保护序列的长度为5-30bp，最优选20bp。根据本专利技术的另一个方面，提供在细胞中产生基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：(1)向细胞中引入能切割细胞基因组中特定靶位点的序列特异性核酸酶和供体构建体；其中所述供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA，所述线性供体DNA由中间向两端依次包含：表达盒；位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的靶序列，所述靶序列含有可被所述序列特异性核酸酶切割的靶位点；位于两端的保护序列；所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因；其中线性供体DNA通过非同源末端连接被插入到细胞基因组中的特定靶位点；(2)筛选所述标记物表达阳性的细胞。在本专利技术中，所述线性供体DNA是双链线性供体DNA。在优选的实施方案中，所述供体构建体是线性供体DNA。在一些实施方案中，所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有靶序列。在一些实施方案中，所述线性供体DNA在两端分别具有靶序列。在一些实施方案中，所述线性供体DNA中两端的靶序列相同。在一些实施方案中，所述线性供体DNA中两端的靶序列不同。在进一步的实施方案中，所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于相同的基因。在其它进一步的实施方案中，所述线性供体DNA中两端的不同靶序列来自于不同的基因。在一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。在另一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)。在另一些实施方案中，所述序列特异性核酸酶是Cas9核酸酶。在优选的实施方案中，所述方法还包括向细胞中引入识别细胞基因组中特定靶位点的向导RNA(gRNA)，线性供体DNA中的靶序列包含被所述gRNA识别的靶位点。在一些实施方案中，所述gRNA是sgRNA。在更优选的实施方案中，所述方法还包括向细胞中引入识别细胞基因组中单个特定靶位点的sgRNA，包含被所述sgRNA识别的本文档来自技高网...

【技术保护点】
通用供体构建体，所述通用供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA，所述线性供体DNA由中间向两端依次包含：表达盒；位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的通用靶序列，所述通用靶序列含有可被Cas9核酸酶切割的靶位点；位于两端的保护序列；/n其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因；/n其中所述通用靶序列在待进行基因敲除的细胞的基因组中不存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】通用供体构建体，所述通用供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA，所述线性供体DNA由中间向两端依次包含：表达盒；位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的通用靶序列，所述通用靶序列含有可被Cas9核酸酶切割的靶位点；位于两端的保护序列；
其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因；
其中所述通用靶序列在待进行基因敲除的细胞的基因组中不存在。


权利要求1的通用供体构建体，其是线性供体DNA，优选是双链线性供体DNA。
优选地，所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有所述通用靶序列，或者所述线性供体DNA在两端分别具有所述通用靶序列。
更优选地，其中所述标记物基因是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。


权利要求1-2任一项的通用供体构建体，其中所述保护序列的长度为5-30bp，最优选20bp。
优选地，所述通用靶序列含有5'-GTACGGGGCGATCATCCACA-3'或5'-AATCGACTCGAACTTCGTGT-3'。


在细胞中产生基因敲除的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)向细胞中引入：
(a)Cas9核酸酶；
(b)识别细胞基因组中特定靶序列的gRNA；
(c)通用供体构建体，其中所述通用供体构建体是线性供体DNA或可在细胞中被切割产生线性供体DNA，所述线性供体DNA由中间向两端依次包含：表达盒；位于表达盒5'端的由反向终止密码子组成的短的序列延伸和位于表达盒3'端的由正向终止密码子组成的短的序列延伸；位于5'端和/或3'端的通用靶序列，所述通用靶序列含有可被Cas9核酸酶切割的靶位点；位于两端的保护序列；
其中所述表达盒包含由启动子驱动的标记物基因；
其中所述通用靶序列在待进行基因敲除的细胞的基因组中不存在；
(d)识别线性供体DNA中包含的通用靶序列的gRNA；

(2)所述线性供体DNA通过非同源末端连接被插入到细胞基因组中的特定靶位点；
(3)筛选所述标记物表达阳性的细胞。


权利要求4的方法，其中所述通用供体构建体是线性供体DNA，优选是双链线性供体DNA。
更优选地，所述线性供体DNA仅在5'端或3'端具有所述通用靶序列，或者所述线性供体DNA在两端分别具有所述通用靶序列。


权利要求4-5任一项的方法，其中所述识别细胞基因组中特定靶序列的gRNA是一种gRNA，或者是多于一种的识别细胞基因组中不同靶序列的gRNA。
优选地，所述识别细胞基因组中特定靶序列的gRNA是sgRNA，和/或所述识别线性供体DNA中包含的通用靶序列的gRNA是sgRNA。
更优选地，其中所述识别细胞基...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏文胜，陈一欧，周悦欣，张鸿敏，袁鹏飞，刘源，
申请(专利权)人：北京大学，博雅缉因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11