【技术实现步骤摘要】
一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法。
技术介绍
目前，最接近的现有技术：提高鱼类生长率，即可以缩短上市时间，提高单位时间内的养殖产量，又可以一定程度上降低鱼类发病率，从而降低养殖风险。鱼类生长速度快慢直接关系到其养殖推广和养殖效益，因此如何增加鱼类生长速度，一直是鱼类相关研究的重点和热点。目前快长转基因鱼研制技术多为基因的过表达技术，且所选用的靶基因均为生长激素基因，例如朱作言院士团队研制的转基因黄河鲤以及目前在美国批准上市的转基因三文鱼。但是在有些鱼类中，过表达生长激素基因，对鱼类生长并没有明显的促进作用，如在已驯化的虹鳟鱼中过表达鲑鱼生长激素基因，并未导致其生长速度加快，因此该方法应用范围有一定的局限性，而且过表达基因产生的转基因鱼，可能具有一定的环境危害，推广养殖难度很大。利用基因编辑技术CRISPR/Cas9沉默基因表达获得快长鱼类品系是近几年研究的热点，该技术同样需要靶基因的寻找和筛选，目前研究最多的靶基因为生长...
【技术保护点】
1.一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：/n第一步，通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；/n第二步，获得actRIIB基因和alk4基因gRNA；/n第三步，体外转录获得Cas9 mRNA；/n第四步，Cas9 mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；/n第五步，F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；/n第六步，F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代；根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体。/n
【技术特征摘要】
1.一种通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法包括以下步骤：
第一步，通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列；
第二步，获得actRIIB基因和alk4基因gRNA；
第三步，体外转录获得Cas9mRNA；
第四步，Cas9mRNA和actRIIB和alk4基因gRNA显微共注射；
第五步，F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定；
第六步，F2代纯合突变个体的获得，待F1代杂合突变个体性成熟后，F1代个体自交获得F2代；根据孟德尔定律，从F2中筛选出纯合突变个体。
2.如权利要求1所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第一步通过NCBI在线数据库查找斑马鱼actRIIB基因和alk4基因mRNA序列和基因组序列包括；
actRIIB基因mRNA序列：NM_131210.3；
actRIIB基因基因组序列：NC_007135.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQIDNO：1；
alk4基因mRNA序列：NM_130990.1；
alk4基因基因组序列：NC_007134.7；
通过序列比对将敲除位点设计在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为SEQIDNO：2。
3.如权利要求1所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼生长速度的方法，其特征在于，所述第二步actRIIB基因和alk4基因gRNA的获得：以gRNA-plasmid为模板，分别以actRIIB-gRNA-F/gRNA-R和alk4-gRNA-F/gRNA-R为引物：
利用KODPlus高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA；然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用T7TranscriptionKit将构建好的质粒体外逆转录20ul反应体系。
4.如权利要求3所述的通过基因敲除技术增加斑马鱼...
【专利技术属性】
技术研发人员：张运生，刘良国，杨品红，
申请(专利权)人：湖南文理学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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