本发明专利技术公开了一种快速建立基因编辑肝癌细胞株的方法。本发明专利技术将CRISPR/Cas 9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，结合快速单克隆培养，构建稳定敲除基因的肝癌细胞株。所需sgRNA通过引物合成精准获得，通过两步PCR合成插入片段装入载体，构建成用于敲除的重组质粒；经包装慢病毒后与肝癌细胞共孵育，通过慢病毒介导将sgRNA与Cas9蛋白同时等量导入肝癌细胞；对基因编辑后的肝癌细胞进行嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选同时进行单克隆化培养，最终快速获得基因敲除阳性的稳定肝癌细胞株。本方法为研究基因在肿瘤发生发展中的分子机理提供了重要的实验材料，对肝癌疾病的体外细胞建模提供参考。
A rapid method and cell line of editing hepatoma cell line with CRISPR gene
【技术实现步骤摘要】
一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株
本专利技术涉及生物医学研究领域中的靶向肿瘤细胞的基因编辑范畴，具体来说，本专利技术涉及一种快速获得基因编辑肝癌细胞株的方法。
技术介绍
肝癌是死亡率占世界第二位的最高发癌症。在我国，肝癌的发病率和死亡率很高，严重危害着国民的身体健康及生活质量。因此，对肝癌发病机制的研究，成为肿瘤生物学研究的热点之一。肝癌是一种基因异常疾病，在癌细胞中形成了数百或数千的突变，使得DNA测序技术确定致癌突变基因的挖掘困难重重。此外，许多肝癌调控基因难以通过测序发现，因为它们不发生突变，而是在癌症中通过其他方式失调控。确定肝癌细胞中的突变基因功能，了解它们的突变致癌的机制以及调控肝癌发生发展过程的重要基因功能是一个重大的挑战。常需要建立细胞模型将目标基因做敲除处理，体外探讨相关基因缺失后的变化，从而了解该基因的功能。CRISPR/Cas是细菌和古细菌在自然界生物长期的进化过程中，演化出了一种独特的适应性免疫系统。在该系统中，一种称之为Cas的限制性内切酶能在短链RNA的引导下，靶向降解外来入侵的DNA或RNA，人们将这一系统命名为CRISPR/Cas，即成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关基因(ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPR-associatedgenes,CRISPRCas)。这一成簇规律间隔的短回文重复序列于1987年首先在大肠杆菌Escherichiacoli染色体上被发现，然而其蕴藏的生物学意义并没有立即被人们所了解。之后的研究显示，CRISPR其实在绝大多数细菌和古细菌中都普遍存在。直到2005年，CRISPR与抗病毒免疫之间的联系才逐渐被人们认识到，随着科学家们的不断发现，直到2012年CRISPR的相关作用机理被真正的了解清楚，开始把它应用于基因编辑领域。2013年，CRISPR-Cas9开始被作为一种基因编辑技术而被广泛使用。现有的CRISPR/Cas9系统实验构建方案：(1)基于DNA载体的实验方案。载体通过转染进入细胞后，U6启动子转录出sgRNA,Cas9基因在细胞内需要转录翻译等多个过程才能表达出Cas9蛋白，两者结合在胞内寻找识别目的序列达到基因编辑的作用。(2)基于sgRNA和mRNAMix的实验方案。sgRNA设计及人工合成后，通过将Cas9的mRNA、人工合成的sgRNA以及混合体直接转染或者注射到待编辑细胞中来提高筛选效率。其原理是由于有些细胞难以通过常规转染的方式导入外源DNA片段，然而通过此方式可以直接将充足的所需基因编辑元件导入细胞体内，达到基因编辑的目的。该方案转染DNA进入细胞，避免了DNA进入细胞后的发生基因重组的可能。该方法的另一个重要目的是由于这样避免了Cas9在体内的持续表达，从而减少了Cas9发挥作用的时间，由此减少脱靶的产生。(3)sgRNA和Cas9protein复合物的实验方案。获得活性验证过的Cas9核酸内切酶，在胞外将sgRNA和Cas9核酸内切酶混合后，采用特殊转染方法转染或者显微注射进入细胞发挥作用。尽管后两种方式各有一定优势，但其无论从操作技术、试验设备及仪器条件、试验对绝大部分实验室的友好程度(可操作性)都有过高要求，普通实验室很难均满足各项要求，因此，第一种方式适合大部分实验室自主操作实施。然而，第一种方式由于载体携带的sgRNA有限，目前肝癌细胞系的基因编辑效率仍不理想，亟需一种新的方法可以使广大实验室都能高效快速的获得基因编辑的肝癌细胞株。因此，应用本专利技术的最终目标是，建立一种快速高效的基因编辑肝癌细胞株的方法，为广大实验室建立肝癌体外研究模型奠定基础。目前在药筛导入sgRNA和Cas9后的肝癌细胞株获得基因编辑阳性细胞株的效率很不理想，通过高效的细胞单克隆化是本专利技术克服这一障碍的技术进步，为后续快速建立基因编辑肝癌细胞株奠定坚实基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgRNA实现快速编辑肝癌细胞基因的方法。该细胞株可作为细胞模型，用于研究基因对肝癌的发生发展的调控机制。本专利技术将CRISPR/Cas9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，结合快速单克隆培养，构建稳定敲除基因的肝癌细胞株。由于采用了优化的CRISPR/Cas9技术，在敲除质粒构建时具有简便、高效及易于在绝大部分实验室可操作的优势。本专利技术提供的一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法，包括如下步骤：(1)sgRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，从NCBI中下载基因的基因组序列并对结构进行分析，找到转录起始区域，将靶位点处选取250bp序列作为sgRNA设计序列，该sgRNA序列由张锋实验室在线设计网站http://crispr.mit.edu/设计，并对sgRNA在基因组中的位置及脱靶效率进行加权筛选，根据sgRNA在线设计软件选取候选的sgRNA。针对不同的敲除片段位点，在靶片段两端(分别在上游和下游)设计一对sgRNA，两条sgRNA间隔在250bp左右，以防止基因组片段被过长剪切后发生染色体变异的问题。以LentivirusV2慢病毒载体为骨架，采用两轮PCR扩增的方法获得待插入片段，随后，使用ESP3I限制性内切酶酶切插入片段及载体，经T4DNA连接酶连接后，构建出同时带有敲除基因片段上下游的两条sgRNA的重组敲除质粒。以下进行两轮PCR扩增的具体步骤：为了获得最终含有两条sgRNA的插入片段，将最终的插入片段分为三部分进行PCR。其插入片段的结构是，sgRNA1+间隔序列+sgRNA2。第一轮PCR分别获得sgRNA1+部分间隔序列和部分间隔序列+sgRNA2，这两个产物。然后，将以上两个产物等比例混合，稀释100倍作为第二轮PCR的模板。每一条插入片段需要设计四条PCR引物。四条PCR引物中，primerI和primerIV分别带有一条sgRNA(sgRNA1或sgRNA2)。如下示例，sgRNA模式为N(20)。而primerII和primerIII为通用引物，在合成其他插入片段用于敲除其他基因时序列不变。片段sgRNA1+部分间隔序列是由primerI(特异引物)和primerII(通用引物)扩增获得，片段部分间隔序列+sgRNA2是由primerIV(特异引物)和primerIII(通用引物)扩增获得。带有sgRNA(sgRNA1或sgRNA2)片段的特异性扩增引物序列为：primerI5′-CGTCTCGCACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtag-3′primerIV5′-CGTCTCcAAACANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3′其中，N代表sgRNA序列。另外两条通用引物序列为：primerII5′-CAAAAAAGCACCGACTCGGTG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法，其特征在于：以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgRNA实现编辑肝癌细胞基因的目的，包括以下步骤：/n1)sgRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，以基因起始密码子处的第一至第三外显子处的基因序列作为靶位点，将靶位点处选取200-250bp序列作为sgRNA设计序列，或根据sgRNA在线设计软件选取候选的sgRNA；/n2)sgRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将靶向基因的1条或2条以上sgRNA序列按5’至3’方向依次连接，作为插入片段克隆至用BmsbI酶酶切好的LentiCRISPR V2载体中，获得含有多条sgRNA的重组敲除质粒；/n3)对阳性重组质粒进行测序鉴定：将所得重组质粒转化到感受态Stbl3菌株中，过夜培养，挑取单菌落，氨苄青霉素抗性LB培养基摇12-16小时；提取质粒，用BsmbI(或同工酶ESP3I酶)酶切鉴定，切下小于2000bp片段表示有目的片段插入，后续将质粒用引物对：Lenti V2 5：CTTGGGTAGTTTGCAGTTTTA和Lenti V2 3：CTCCTTTCAAGACCTAGCTAG进行PCR扩增，再次扩增获得小于2000bp的条带(由于插入sgRNA数量不同PCR产物片段大小不同)，该PCR产物样品可以测序确认sgRNA的序列(测序引物建议使用Lenti V2 3)，测序序列中必须找到目的sgRNAs；测序正确的重组质粒可用于后续病毒包装；/n4)病毒包装：包装质粒PVSVG：PSPAX2：重组质粒＝1：9：10的质量比例包装慢病毒；48-72小时收集病毒培养体系上清液；/n5)转染靶细胞：提前24-48小时将靶细胞根据需要铺板，将48-72小时收集到的含病毒培养液，用0.45微米的滤器过滤加入培养的靶细胞中，以8-10微升聚凝胺(polybrene)每10ml培养基的比例加入培养皿，继续培养24-48小时后，胰酶消化细胞后将细胞重新接种于新的培养皿中，依靶细胞种类加入2-6微克每毫升的嘌呤霉素进行阳性细胞株预筛选3-7天；/n6)细胞的单克隆化培养：将预筛选3-7天的细胞用胰酶消化后，以每孔1-2个细胞的密度重稀释后均匀接种至96孔板，培养至显微镜镜检能观察到细胞单克隆。/n...
【技术特征摘要】
1.一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法，其特征在于：以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgRNA实现编辑肝癌细胞基因的目的，包括以下步骤：
1)sgRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，以基因起始密码子处的第一至第三外显子处的基因序列作为靶位点，将靶位点处选取200-250bp序列作为sgRNA设计序列，或根据sgRNA在线设计软件选取候选的sgRNA；
2)sgRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将靶向基因的1条或2条以上sgRNA序列按5’至3’方向依次连接，作为插入片段克隆至用BmsbI酶酶切好的LentiCRISPRV2载体中，获得含有多条sgRNA的重组敲除质粒；
3)对阳性重组质粒进行测序鉴定：将所得重组质粒转化到感受态Stbl3菌株中，过夜培养，挑取单菌落，氨苄青霉素抗性LB培养基摇12-16小时；提取质粒，用BsmbI(或同工酶ESP3I酶)酶切鉴定，切下小于2000bp片段表示有目的片段插入，后续将质粒用引物对：LentiV25：CTTGGGTAGTTTGCAGTTTTA和LentiV23：CTCCTTTCAAGACCTAGCTAG进行PCR扩增，再次扩增获得小于2000bp的条带(由于插入sgRNA数量不同PCR产物片段大小不同)，该PCR产物样品可以测序确认sgRNA的序列(测序引物建议使用LentiV23)，测序序列中必须找到目的sgRNAs；测序正确的重组质粒可用于后续病...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴海龙，李同明，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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