一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株技术

本发明专利技术公开了一种快速建立基因编辑肝癌细胞株的方法。本发明专利技术将CRISPR/Cas 9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，结合快速单克隆培养，构建稳定敲除基因的肝癌细胞株。所需sgRNA通过引物合成精准获得，通过两步PCR合成插入片段装入载体，构建成用于敲除的重组质粒；经包装慢病毒后与肝癌细胞共孵育，通过慢病毒介导将sgRNA与Cas9蛋白同时等量导入肝癌细胞；对基因编辑后的肝癌细胞进行嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选同时进行单克隆化培养，最终快速获得基因敲除阳性的稳定肝癌细胞株。本方法为研究基因在肿瘤发生发展中的分子机理提供了重要的实验材料，对肝癌疾病的体外细胞建模提供参考。

A rapid method and cell line of editing hepatoma cell line with CRISPR gene

【技术实现步骤摘要】
一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法及细胞株
本专利技术涉及生物医学研究领域中的靶向肿瘤细胞的基因编辑范畴，具体来说，本专利技术涉及一种快速获得基因编辑肝癌细胞株的方法。
技术介绍
肝癌是死亡率占世界第二位的最高发癌症。在我国，肝癌的发病率和死亡率很高，严重危害着国民的身体健康及生活质量。因此，对肝癌发病机制的研究，成为肿瘤生物学研究的热点之一。肝癌是一种基因异常疾病，在癌细胞中形成了数百或数千的突变，使得DNA测序技术确定致癌突变基因的挖掘困难重重。此外，许多肝癌调控基因难以通过测序发现，因为它们不发生突变，而是在癌症中通过其他方式失调控。确定肝癌细胞中的突变基因功能，了解它们的突变致癌的机制以及调控肝癌发生发展过程的重要基因功能是一个重大的挑战。常需要建立细胞模型将目标基因做敲除处理，体外探讨相关基因缺失后的变化，从而了解该基因的功能。CRISPR/Cas是细菌和古细菌在自然界生物长期的进化过程中，演化出了一种独特的适应性免疫系统。在该系统中，一种称之为Cas的限制性内切酶能在短链RNA的引导下，靶向降解外来入侵的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法，其特征在于：以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgRNA实现编辑肝癌细胞基因的目的，包括以下步骤：/n1)sgRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，以基因起始密码子处的第一至第三外显子处的基因序列作为靶位点，将靶位点处选取200-250bp序列作为sgRNA设计序列，或根据sgRNA在线设计软件选取候选的sgRNA；/n2)sgRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将靶向基因的1条或2条以上sgRNA序列按5’至3’方向依次连接，作为插入片段克隆至用BmsbI酶酶切好的LentiCRISP...

【技术特征摘要】
1.一种快速建立CRISPR基因编辑肝癌细胞株的方法，其特征在于：以肝癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导sgRNA实现编辑肝癌细胞基因的目的，包括以下步骤：
1)sgRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，以基因起始密码子处的第一至第三外显子处的基因序列作为靶位点，将靶位点处选取200-250bp序列作为sgRNA设计序列，或根据sgRNA在线设计软件选取候选的sgRNA；
2)sgRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将靶向基因的1条或2条以上sgRNA序列按5’至3’方向依次连接，作为插入片段克隆至用BmsbI酶酶切好的LentiCRISPRV2载体中，获得含有多条sgRNA的重组敲除质粒；
3)对阳性重组质粒进行测序鉴定：将所得重组质粒转化到感受态Stbl3菌株中，过夜培养，挑取单菌落，氨苄青霉素抗性LB培养基摇12-16小时；提取质粒，用BsmbI(或同工酶ESP3I酶)酶切鉴定，切下小于2000bp片段表示有目的片段插入，后续将质粒用引物对：LentiV25：CTTGGGTAGTTTGCAGTTTTA和LentiV23：CTCCTTTCAAGACCTAGCTAG进行PCR扩增，再次扩增获得小于2000bp的条带(由于插入sgRNA数量不同PCR产物片段大小不同)，该PCR产物样品可以测序确认sgRNA的序列(测序引物建议使用LentiV23)，测序序列中必须找到目的sgRNAs；测序正确的重组质粒可用于后续病...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴海龙，李同明，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21