一种真核生物的基因改造方法及其相应的基因工程细胞及应用技术

本发明专利技术提供一种真核生物的基因改造方法，其在真核生物的基因组中通过基因编辑技术将eIF2Bδ基因与T7 RNA聚合酶基因融合和/或将eIF2Bε基因与T7 RNA聚合酶基因融合。经试验验证，T7 RNA聚合酶和eIF2B复合体的两个亚基eIF2Bδ和eIF2Bε分别融合都能显著提高无细胞体系的蛋白表达能力。同时，本发明专利技术提供包含利用该基因改造方法进行改造的基因工程细胞，以及包含该基因工程细胞制备的细胞提取物的真核无细胞蛋白质合成体系。

A eukaryotic gene transformation method and its corresponding gene engineering cell and its application

【技术实现步骤摘要】
一种真核生物的基因改造方法及其相应的基因工程细胞及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及eIF2Bδ和eIF2Bε与T7RNA聚合酶基因融合可以增强真核生物无细胞蛋白反应体系的蛋白合成能力。
技术介绍
无细胞蛋白反应体系是指以外源的mRNA或者DNA为模板，利用细胞抽提物的酶系中来合成蛋白质的体外系统。与传统的体内重组表达系统相比，无细胞蛋白反应体系有很多优点，如可以表达具有细胞毒性的蛋白或者含有非天然氨基酸的特殊蛋白质，而且利用其操作简便性可以进行高通量药物筛选和蛋白质组学研究。目前常用的无细胞蛋白质合成系统包括原核的大肠杆菌系统，真核的麦胚提取物和兔网织红细胞裂解物系统。酵母细胞属于真核细胞，同时酵母细胞可以通过发酵途径大量获取，因此酵母细胞抽提物系统兼具真核系统的蛋白修饰功能和大规模工业化应用的优势。但是目前市场上还没有成熟的酵母细胞抽提物系统，我们致力开发的克鲁维酵母抽提物系统可以填补这方面的空白。在开发克鲁维酵母抽提物的无细胞蛋白反应体系过程中，一个重要的目标是提高该体系的蛋白合成能力。影响无细胞系统中蛋白合成的因素很多，比如DNA转录的强度、mRNA模板的稳定性、翻译相关因子的活性、能量和原料的丰富程度以及副产物的清除等。其中有很多翻译因子对于蛋白合成有至关重要的作用，尤其是翻译前复合物（pre-initiationcomplex）的形成是蛋白翻译过程中的限速步骤。通过基因工程可以定向改变基因和蛋白质的功能，使得无细胞蛋白质合成系统的蛋白合成能力增强。同时近年兴起的CRISPR-Cas9技术作为高效基因组DNA编辑的工具广泛应用于各种细胞。我们利用CRISPR-Cas9技术对克鲁维酵母进行基因工程改造，使得其抽提物具有更强的蛋白合成能力。乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis，以下简称K.lactis）是工业上广泛使用的酵母，与其他酵母相比，具有许多优点，如超强的分泌能力、良好的大规模发酵特性、较高的食品安全级别及具备蛋白翻译后修饰的能力等。我们利用CRISPR-Cas9技术将T7噬菌体来源的T7RNA聚合酶和乳酸克鲁维酵母细胞的翻译因子融合表达，目的是希望能将DNA的转录和转录产物RNA的翻译耦连起来。意外的，我们发现T7RNA聚合酶和eIF2B复合体的两个亚基eIF2Bδ和eIF2Bε分别融合都能显著提高无细胞体系的蛋白表达能力。
技术实现思路
本专利技术第一方面提供一种真核生物的基因改造方法，其是在真核生物的基因组中通过基因编辑技术将eIF2Bδ基因与T7RNA聚合酶基因融合和/或将eIF2Bε基因与T7RNA聚合酶基因融合。进一步的，基因编辑技术为现有技术，可以选择CRISPR/Cas9基因编辑技术。进一步的，基因融合采用两个基因直接连接的直接融合方式或者通过连接序列（Linker）将两个基因进行连接。进一步的，T7RNA聚合酶基因与eIF2B亚基（eIF2Bδ、eIF2Bε）基因C端融合或者是N端融合。本专利技术第二方面提供一种基因工程细胞，该基因工程细胞的基因组中包含利用第一方面的基因改造方法进行的改造。进一步的，所述细胞为真核细胞。进一步的，所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。进一步的，酵母细胞选自酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母属酵母之一或其组合。进一步的，所述克鲁维酵母属酵母选自乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母之一或其任意组合。本专利技术第三方面提供一种真核无细胞蛋白质合成体系，该合成体系至少包括细胞提取物，所述细胞提取物来自于第二方面中任一项基因工程细胞。进一步的，可以在该无细胞蛋白合成体系中额外添加T7RNA聚合酶。本专利技术第四方面提供第一方面中所述基因改造方法、第二方面中所述基因工程细胞在提高真核无细胞蛋白质合成体系中外源蛋白表达量中的应用。本专利技术第五方面提供一种提高真核无细胞蛋白合成体系中外源蛋白表达量的方法，该方法包括：步骤1，提供第三方面所述的真核无细胞蛋白合成体系；步骤2，在步骤1的合体体系中加入编码外源蛋白的DNA分子，在一定条件下进行孵育，合成所述的外源蛋白。进一步的，反应温度为20-35℃，优选的为20-30℃。进一步的，反应时间为0.5-20h，优选的为1-18h，更优选的为2-15h，更优选的为3-12h；上述反应时间可根据具体情况人为确定，也可以为3-15h。本专利技术的主要优点包括：(1)本专利技术通过基因定向改造以及活性测定，首次提出在eIF2Bδ亚基的C端融合T7RNA聚合酶可以提高无细胞体系的蛋白合成能力。(2)本专利技术通过基因定向改造以及活性测定，首次提出在eIF2Bε亚基的C端融合T7RNA聚合酶可以提高无细胞体系的蛋白合成能力。附图说明图1是真核生物基因组中eIF2B的δ和ε亚基与T7RNA聚合酶融合的示意图。图2是pCas9_KleIF2Bδ的质粒图谱。该质粒带有K.lactisSNR52启动子和SNR52终止子，并带有kana筛选标记。图3是pKMD1-eIF2Bδ-Linker-T7的质粒图谱。eIF2Bδ的C端编码序列800bp是HR1，Linker和T7转录酶的DNA序列是按照K.lactis细胞的密码子偏好性进行优化的，eIF2Bδ终止密码子下游的800bp是HR2，质粒带有Amp筛选标记。图4是pCas9_KleIF2Bε的质粒图谱。该质粒带有K.lactisSNR52启动子和SNR52终止子，并带有kana筛选标记。图5是pKMD1-eIF2Bε-Linker-T7的质粒图谱。eIF2Bε的C端编码序列800bp是HR1，Linker和T7转录酶的DNA序列是按照K.lactis细胞的密码子偏好性进行优化的，eIF2Bδ终止密码子下游的800bp是HR2，质粒带有Amp筛选标记。图6是eIF2Bδ-T7和eIF2Bε-T7菌株和野生型菌株无细胞体系绿色荧光蛋白合成量的比较。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究，发现不同改造菌株中有两株工程细胞株的抽提物能显著提高外源目的蛋白的合成。该两株工程菌是T7RNA聚合酶基因分别与乳酸克鲁维酵母内源eIF2B复合物的两个亚基eIF2Bδ基因和eIF2Bε基因融合，分别得到eIF2Bδ-T7细胞株（eIF2Bδ-T7工程细胞）和eIF2Bε-T7细胞株（eIF2Bε-T7工程细胞）。相比野生型乳酸克鲁维酵母细胞，含有本专利技术的eIF2Bδ-T7工程细胞和/或eIF2Bε-T7工程细胞的细胞提取物的体外无细胞蛋白合成体系可显著提高外源蛋白的表达产量。术语为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真核生物的基因改造方法，其特征在于：在真核生物的基因组中通过基因编辑技术将eIF2Bδ基因与T7 RNA聚合酶基因融合和/或将eIF2Bε基因与T7 RNA聚合酶基因融合。/n

【技术特征摘要】
1.一种真核生物的基因改造方法，其特征在于：在真核生物的基因组中通过基因编辑技术将eIF2Bδ基因与T7RNA聚合酶基因融合和/或将eIF2Bε基因与T7RNA聚合酶基因融合。


2.一种基因工程细胞，其特征在于：所述基因工程细胞的基因组中包含利用权利要求1所述的基因改造方法进行的改造。


3.根据权利要求2所述的基因工程细胞，其特征在于：所述细胞为真核细胞。


4.根据权利要求3所述的基因工程细胞，其特征在于：所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞之一或其任意组合。


5.根据权利要求4所述的基因工程细胞，其特征在于：酵母细胞选自酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母属酵母之一或其组合。


6.根据权利要求5所述的基因工程细胞，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，许乃庆，姜灵轩，娄旭，邓蜜妮，杨旭，占魁，李海洋，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31