一种FAP抑制剂的活性检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种FAP抑制剂的活性检测方法。该方法包括以下步骤：步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly‑Pro‑AMC、Cbz‑Gly‑Pro‑AMC、Suc‑Gly‑Pro‑AMC中的任意一种；步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。本发明专利技术提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法，可对不同亲和力的FAP抑制剂进行活性检测，灵敏度高。

A method for detecting the activity of FAP inhibitors

【技术实现步骤摘要】
一种FAP抑制剂的活性检测方法
本专利技术属于生物
，更具体地，涉及一种FAP抑制剂的活性检测方法。
技术介绍
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是二肽酶(DPP)家族中的成员，FAP与DPP4具有相似的结构域(52％的同源性)及二肽基肽酶活性，是一种与癌症相关成纤维细胞(CAF)的标志物，对于促进肿瘤发展有重要作用。研究表明FAP既可以作为肿瘤的潜在靶点，又可以作为肿瘤、类风湿性关节炎等疾病早期诊断标志物。作为体内的蛋白，FAP可以水解多种底物，经过长时间的研究与探索，FAP的天然底物有胶原纤维蛋白、α2-抗纤维蛋白、成纤维细胞生长因子21(FGF21)等。它可以特异性地识别、分解C端的甘氨酸-脯氨酸(G-P)序列。基于此特点，多种FAP酶及其抑制剂的活性检测方法相继被报道，这些检测方法可分为体内检测法和体外检测法，其中体外检测法研究最热的是荧光探针分子。目前，FAP的相关荧光探针多以香豆素为荧光基团。Aggarwal等运用荧光探针Ala-Pro-AFC对FAP体外酶活性进行检测，通过其水解产生的AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)(λex/em＝370/535nm)的荧光响应来反映FAP活性，并测定了Ala-Pro-AFC的水解反应速率，但由于荧光探针自身化学属性差或选择性等问题，除了可以被具有内肽酶活性的酶(如FAP)水解外，外肽酶活性的酶(如DPP4)也能水解Ala-Pro-AFC产生AFC。有研究报道使用HEK293细胞系来表达FAP蛋白，但由于HEK293细胞系需经转染使用，操作繁琐，且生长过程中贴壁强度比较小，在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。也有研究人员应用人、鼠、猴血清中的游离FAP进行测试，但也存在成本高、生物样本获取难等问题，同时也无法完整发挥FAP蛋白在生物体内的酶功能。因此，本领域亟需研发一种FAP抑制剂的活性检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有检测方法选择性差、细胞系培养缺陷、成本高等诸多问题，而提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法。本专利技术提供一种FAP抑制剂的活性检测方法，包括以下步骤：步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种；步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。根据本专利技术的方法，优选地，所述FAP蛋白由U87MG细胞系、HT1080细胞系或PC-3细胞系表达。优选U87MG细胞系，该细胞系为人恶性胶质瘤细胞系，能够高表达FAP蛋白。进一步地，水解反应体系中，所述细胞系的细胞计数为(50～150)万/mL，优选细胞计数为100万/mL。本专利技术中，选择带有AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)荧光基团的底物分子进行检测。可通过以下方法检测底物分子与FAP蛋白的亲和力：步骤一：将FAP蛋白和不同浓度的底物分子反应，得到水解产物；步骤二；对步骤一得到的水解产物进行荧光检测，以底物浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，计算Km值。所述Km值即可反映底物分子与FAP蛋白的亲和力大小，Km值越小，亲和力越高，反之亦然。其中，所述底物分子使用缓冲液稀释至5μM～2mM之间的8～10个浓度梯度。根据上述方法，本专利技术选择Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种作为底物分子，其中，Cbz-Gly-Pro-AMC中的Cbz(benzyloxycarbonyl)为保护基团，本文亦简称为Z-Gly-Pro-AMC。三种底物分子中，Suc-Gly-Pro-AMC为最优选。检测时，水解反应体系中，所述底物分子的浓度可以为5μM～2mM，优选底物分子浓度为25μM。本专利技术所用的Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC可通过商购获得，也可以通过常规合成方法制得。根据本专利技术的方法，水解反应体系中，所述不同浓度的FAP抑制剂的浓度范围为500pM～2μM(例如，500pM，1nM，5nM，50nM，500nM，2μM)。进一步地，所述水解反应的溶液选自pH7.0～8.0PBS缓冲液或Tris-NaCl缓冲液，优选为PBS缓冲液。由于本专利技术选择的荧光基团为AMC，相应地，所述荧光检测的条件包括：激发波长为380nm，发射波长为460nm。本专利技术上述底物分子筛选和所述FAP抑制剂的活性检测原理如下：由一定细胞计数的细胞系(FAP蛋白供体)水解不同浓度梯度的底物分子，释放荧光基团AMC，该基团产生的荧光强度与FAP水解底物的量成一定比例，通过酶标仪读取荧光强度，以底物浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，计算Km值，从而判断底物分子与FAP蛋白之间的亲和力，筛选出合适的底物分子。将不同浓度的FAP抑制剂和一定细胞计数的细胞系混合，再与一定浓度的底物分子反应，此时FAP抑制剂浓度越大，抑制水解反应的能力越强，从而荧光强度越弱，通过酶标仪读取荧光强度，经软件处理计算IC50值。IC50值越小，说明该抑制剂对FAP蛋白的抑制能力越强，从而筛选出合适的FAP抑制剂。本专利技术中，Km表示酶促反应达最大速度一半时底物的浓度；IC50表示达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。本专利技术的有益效果：1)本专利技术提供了一种FAP抑制剂的活性检测方法，可对不同亲和力的FAP抑制剂进行活性检测，灵敏度高。2)本专利技术操作简单，所用细胞系、底物及缓冲液等物质均为实验室常规应用，来源广泛、易得，成本低。3)本专利技术所采用的底物只能特异性被FAP蛋白水解，而DPP4蛋白对其不具有水解能力，选择性好。4)因PREP为细胞质蛋白质，而本专利技术底物较少进入细胞，因此可近乎避免PREP的干扰，适合FAP抑制剂的活性筛选。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1为底物Suc-Gly-Pro-AMC的Km值曲线图。图2为FAP抑制剂UAMC-1110的IC50曲线图。图3为U87MG细胞与底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC或底物Z-Gly-Pro-AMC，Suc-Gly-Pro-AMC加FAP抑制剂(UAMC-1110)反应90分钟的荧光值变化图。其中，图3A中，上方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Z-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图3B中，上方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC，下方曲线代表Suc-Gly-Pro-AMC+UAMC-1110，图3C中，左侧柱代表Z-Gly-Pro-AMC，右侧柱代表Suc-Gly-Pro-AMC。图4为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种；/n步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：将不同浓度的FAP抑制剂和FAP蛋白混合，再与底物分子进行水解反应，得到水解产物；所述底物分子选自Gly-Pro-AMC、Cbz-Gly-Pro-AMC、Suc-Gly-Pro-AMC中的任意一种；
步骤S2：对步骤S1得到的水解产物进行荧光检测。


2.根据权利要求1所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，所述FAP蛋白由U87MG细胞系、HT1080细胞系或PC-3细胞系表达。


3.根据权利要求2所述的FAP抑制剂的活性检测方法，其特征在于，水解反应体系中，所述细胞系的细胞计数为(50～150)万/mL。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨兴，王荣福，张炳晔，
申请(专利权)人：北京大学第一医院，
类型：发明
国别省市：北京;11