一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用技术

本发明专利技术提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用，属于检测分析技术领域。本发明专利技术中的生物传感器至少多肽‑DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2。本发明专利技术将含有氨基酸残基的第一引物DNA转化成不含氨基酸残基的新引物DNA，可以完全消除核酸扩增过程中的空间位阻效应，以增加扩增反应效率。同时，多个链置换反应的进行及核糖核酸酶H的循环消化作用可进一步放大荧光信号，因此可实现对组织蛋白酶B活性的超灵敏检测，具有良好的实际应用之价值。

A biosensor for cathepsin B detection and its detection method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用
本专利技术属于检测分析
，具体涉及一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。半胱氨酸组织蛋白酶是一类位于胞内溶酶体泡内的蛋白酶，其功能是介导蛋白质的大量溶解。半胱氨酸组织蛋白酶主要根据不同的催化中心分为组织蛋白酶B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X等11种，在抗原呈递和骨吸收中发挥重要作用。组织蛋白酶B可裂解特异性肽序列，使细胞粘附蛋白失活，激活其他蛋白酶(如层粘连蛋白)，降解细胞外基质，释放实体瘤转移细胞，使癌细胞侵袭转移。组织蛋白酶B在多种癌症中过表达，如喉癌、甲状腺癌、口腔癌、乳腺癌和结肠直肠癌，组织蛋白酶B正成为一种有前途的肿瘤生物标志物，其浓度和分布可用于指导癌症的诊断和合适的抗癌药物的选择。因此，准确、灵敏地检测组织蛋白酶B对于早期癌症的诊断和治疗至关重要。到目前为止，组织蛋白酶B的检测方法多种多样，主要分为亲和法和活性法。酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化法可以根据组织蛋白酶B与抗原的亲和力检测组织蛋白酶B的总浓度，酶联免疫吸附法已被广泛用于检测组织蛋白酶B在血清、尿液和组织裂解液中的浓度。但这些检测是耗时的，需要特定的抗体。活性测定法可以检测蛋白酶的活性，而不是检测蛋白酶的浓度，它更贴近生物学过程，能反映靶标的真实生物学功能，在癌症诊断中特别有用。采用紫外分光光度法对设计的多肽底物进行催化裂解，检测组织蛋白酶B的蛋白水解活性，筛选组织蛋白酶B的抑制作用。但该方法耗时长、样品消耗量大、自动化程度低。电化学检测技术因其易于微型化、简单的直接电子读出、低成本和利用电极阵列同时检测多个蛋白酶的能力而受到关注，因此，它有可能成为一种疾病诊断、治疗监测和药物筛选的方法。然而，这种方法对于研究复杂癌细胞裂解物或组织裂解物中的蛋白酶非常有限。近年来，基于荧光共振能量转移的蛋白酶传感器被开发出来用于检测组织蛋白酶B的活性，其中荧光染料和淬灭标记多肽被水解成分离片段后都会发出强烈的荧光。但这些方法需要设计复杂的荧光共振能量转移染料对，且灵敏度较差。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感器及其检测方法和应用。本专利技术通过磁珠分离辅助多肽-DNA共轭物与等温多路循环信号放大相结合来实现，将DNA聚合酶介导的链延长与核酸酶介导的单链刻痕相结合，基于多链置换反应的循环信号扩增具有扩增效率高、反应温度等温、扩增动力学快等优点。利用循环信号放大，磁珠分离效率高，以及核糖核酸酶H(RNaseH)驱动消化的高特异性，可实现对组织蛋白酶B活性的超灵敏检测，因此具有良好的实际应用之价值。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一种检测组织蛋白酶B的生物传感器，所述生物传感器至少包括多肽-DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2；其中，所述多肽-DNA偶联物含有组织蛋白酶B的生物素化肽底物，其中肽底物C端修饰有生物素，肽底物N端与DNA5'端连接；多肽-DNA偶联物的DNA部分作为核酸扩增反应的引物；所述DNA模板1包含三个主要区域X*-Y*-Z*；所述DNA模板2包含三个主要区域Z*-Y*-X*；其中序列X*与多肽-DNA偶联物结合的DNA部分和生成的触发器X互补，序列Y*与生成的触发器Y互补，序列Z*与生成的触发器Z互补。进一步的，上述两个DNA模板中，Y*的左右两侧分别设计了限制性核酸内切酶的识别位点。所述检测组织蛋白酶B的生物传感器还包括信号探针，所述信号探针为一个RNA寡核苷酸，在所述RNA寡核苷酸两端分别使用荧光剂和猝灭剂进行修饰，所述信号探针可以与触发器Z结合，形成RNA-DNA双链。所述检测组织蛋白酶B的生物传感器还包括磁珠、DNA聚合酶和核糖核酸酶H。其中，所述磁珠为链霉亲和素修饰的磁珠，从而使得生物素化多肽-DNA偶联物可通过生物素-链霉亲和素相互作用在磁珠表面进行组装；所述DNA聚合酶用于引发链的延伸，产生丰富的X、Y、Z触发器。所述核糖核酸酶H可以选择性地消化信号探针与触发器Z结合形成的RNA-DNA双链中的RNA寡核苷酸，产生明显的荧光团荧光信号，同时释放Z触发器。本专利技术的第二个方面，提供一种检测组织蛋白酶B的方法，所述方法包括：1)将多肽-DNA偶联物与磁珠共孵育得多肽-DNA-磁珠轭合物；2)向步骤1)中加入待测样品共孵育进行切除反应，上清液磁分离待用；3)向步骤2)处理后的上清液中加入DNA模板1、DNA模板2和信号探针共孵育进行酶辅助级联信号放大。所述检测组织蛋白酶B的方法还包括对反应产物进行实时荧光检测和/或凝胶电泳，以及荧光光谱测量。本专利技术的第三个方面，提供上述生物传感器和/或检测方法在组织蛋白酶B活性检测和/或筛选组织蛋白酶B相关药物中的应用。需要说明的是，本专利技术虽然以检测组织蛋白酶B为例，提供相关检测生物传感器以及检测方法，但是基于本专利技术的构思，如将多肽-DNA偶联物中的肽底物进行替换用于检测其他组织蛋白酶或者其他酶类等显然也是容易想到的，因此同样应属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益技术效果：1)高灵敏度本专利技术利用了高效率的恒温指数扩增方法和核糖核酸酶H的特异性循环消化，将检测信号进行了循环放大，具有超高的灵敏度。这种方法可以检测到组织蛋白酶B活性的检出限极低，为8.1×10-12克每毫升，动态范围大，从1×10-11到1×10-7克每毫升，可达4个数量级，本专利技术的灵敏度比电化学方法(2.4×10-6克每毫升)提高了5个数量级，比比色法(2.2×10-7克每毫升)提高了4个数量级。2)高特异性由于本专利技术是基于组织蛋白酶B对切割位点的特异性识别，反应十分精确，保证了该方法的高特异性。核糖核酸酶H只能水解RNA-DNA双链中的RNA，这也大大减少了该方法的非特异性。3)可以在单个癌细胞中定量本专利技术可以进一步扩展为在单个癌细胞中准确地确定组织蛋白酶B活性的诊断工具。4)反应时间短本专利技术检测方法中总反应时间约为2.5小时，优于文献报道的组织蛋白酶B测定方法。将有氨基酸残基的引物DNA转化成无氨基酸残基的新引物DNA，可以完全消除核酸扩增的空间位阻效应，扩增反应效率高。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为多肽-DNA结合多重循环信号扩增用于组织蛋白酶B检测的方案原理图。图2A为组织蛋白酶B介导的裂解反应的非变性凝胶电泳监测。条带1，多肽-DNA结合物；条带2，多肽-DNA结合物+组织蛋白酶B。图2B为扩增产物的非变性凝胶电泳分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测组织蛋白酶B的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少多肽-DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2；/n其中，/n所述多肽-DNA偶联物含有组织蛋白酶B的生物素化肽底物，其中肽底物C端修饰有生物素，肽底物N端与DNA 5'端连接；多肽-DNA偶联物的DNA部分作为核酸扩增反应的引物；/n所述DNA模板1包含三个主要区域X*-Y*-Z*；/n所述DNA模板2包含三个主要区域Z*-Y*-X*；/n其中序列X*与多肽-DNA偶联物结合的DNA部分和生成的触发器X互补，序列Y*与生成的触发器Y互补，序列Z*与生成的触发器Z互补。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测组织蛋白酶B的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器至少多肽-DNA偶联物，DNA模板1和DNA模板2；
其中，
所述多肽-DNA偶联物含有组织蛋白酶B的生物素化肽底物，其中肽底物C端修饰有生物素，肽底物N端与DNA5'端连接；多肽-DNA偶联物的DNA部分作为核酸扩增反应的引物；
所述DNA模板1包含三个主要区域X*-Y*-Z*；
所述DNA模板2包含三个主要区域Z*-Y*-X*；
其中序列X*与多肽-DNA偶联物结合的DNA部分和生成的触发器X互补，序列Y*与生成的触发器Y互补，序列Z*与生成的触发器Z互补。


2.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，两个DNA模板中，Y*区域的左右两侧设置有限制性核酸内切酶的识别位点。


3.如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，
所述X*序列为5'-AACAGACTCACTACGACCGGGAC-3'(SEQIDNo.1)；或，
所述Y*序列为5'-AACAGACTCCACAAATTCGACC-3'(SEQIDNo.2)；或，
所述Z*序列为5'-CGTGAATAACTCTACTATC-3'(SEQIDNo.3)；或，
所述DNA模板1核苷酸序列为：5'-CGTGAATAACTCTACTATCAACAGACTCCACAAATTCGACCAACAGACTCACTACGACCGGGAC-磷酸基团-3'(SEQIDNo.4)；其中，下划线区域表示Nt.BstNBI的识别位点；或，
所述DNA模板2核苷酸序列为：5'-AACAGACTCACTACGACCGGGACAACAGACTCCACAAATTCGACCAACAGACTCCGTGAATAACTCTACTATC-磷酸基团-3'(SEQIDNo.5)；其中，下划线区域表示Nt.BstNBI的识别位点；或，
所述含有组织蛋白酶B的生物素化肽底物具体为生物素修饰的KGFRLC(SEQIDNo.6)；或，
所述多肽-DNA偶联物中DNA的序列为5'-GTCCCGGTCGTAGTGAGTCT-3'(SEQIDNo.7)；或，
所述多肽-DNA偶联物的序列为：Cterm-生物素-KGFRLC-Nterm-G...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，王子月，张程鹏，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37