一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置及方法，所述装置包括发酵单元、膜分离单元、丙酸分离单元和维生素B12的转化单元，所述发酵单元的出料口通过膜分离单元与丙酸分离单元和维生素B12的转化单元的进料口相连接，所述丙酸分离单元的出料口与发酵单元的回流口相连接；所述膜分离单元包括膜分离设备，所述膜分离设备包括膜芯，所述膜芯的孔径为0.1‑0.22μm。本发明专利技术方法和装置不仅有效解决了丙酸对发酵的反馈抑制作用，还克服了扩张床填充效率低，难以放大的劣势，不仅有效解决了丙酸对发酵的反馈抑制作用，还克服了扩张床填充效率低，难以放大的劣势，还有效解决了DMB添加对发酵废水资源化利用的不利影响，实现了发酵废液的循环利用。

Production of propionic acid combined with vitamin B by semicontinuous fermentation

The invention provides a semi continuous fermentation for producing propionic acid combined with vitamin B

【技术实现步骤摘要】
一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置及方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置及方法，尤其涉及膜分离技术和层析技术耦合发酵联产维生素B12和丙酸的工艺。
技术介绍
费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)是美国FDA和美国饲料控制官员协会(AAFCO)批准使用的饲用微生物菌种，也是厌氧法发酵生产维生素B12的生产菌株。维生素B12厌氧发酵工艺的动力消耗低，一直被大多数生产企业采用。但是，近年来随着脱氮假单孢菌(Pscudomonasdenitrificans)好氧发酵维生素B12的水平逐步提高，厌氧发酵工艺的优势已经无法突显。因此，提高费氏丙酸杆菌厌氧发酵维生素B12的效率，具有重要的经济价值和应用前景。费氏丙酸杆菌发酵生产维生素B12的同时，会产生以丙酸为主的胞外代谢产物，而发酵液中丙酸的不断积累会对菌体细胞生长及丙酸自身代谢产生反馈抑制作用。为了解除丙酸对发酵的反馈抑制作用，研究人员对生产菌株进行了基因改造(BiotechnologyandBioengineering,2009,104:766-773；MetabolicEngineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反馈抑制机理(JournalofBiotechnology,2013,167:56-63)，并采取适当的调控策略(BioresourceTechnology,2012,105:128-133；BioresourceTechnology,2013,135:504-512)来提高批次发酵过程中丙酸的产量。此外，研究还发现，在发酵过程中采用过程工程手段及时移除丙酸，可有效效减缓或消除其对发酵的反馈抑制作用，提高发酵效率。“AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2001,56:676-680”报道了Goswami构建了一种原位细胞截留反应器，通过不锈钢旋转过滤器将菌体细胞截留，使含高浓度丙酸的发酵清液滤过，从而实现了菌体细胞与丙酸的分离。“JournalofBiotechnology,2012,164:202-210”报道了，南京工业大学欧阳平凯院士构建了一种多孔纤维床反应器将发酵过程中产生的丙酸及时分离出来，提高了发酵产率。“BioresourceTechnology,2012,112:248-253”报道了，浙江大学徐志南教授通过将菌体细胞固定化在纤维床反应器上，采用流加葡萄糖的方式，提高了发酵效率。“BioresourceTechnology,2012,104：652-659”报道了，中科院过程所王云山研究员将扩张床层析技术与发酵过程耦合起来，建立了一种以扩张床原位吸附为特征的新型发酵过程，提高了维生素B12的产量。但是，在工业生产过程中，上述工艺普遍面临着难以放大、成本高等问题。为了进一步提高发酵效率和底物转化率，降低发酵成本，中科院过程所王云山研究员提出，应该将丙酸从副产物的角色转变成目标产物，在扩张床耦合发酵的基础上，实现维生素B12和丙酸的联产，达到“一菌两用”的目标。“AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014,98:7761-7772”研究发现，费氏丙酸杆菌代谢合成丙酸与EMP途径和Wood-Werkmman途径密切相关。从丙酸发酵和维生素B12的代谢途径可以看出，CoA转移酶可以将丙酰CoA上的辅酶转移至琥珀酸上，从而生成丙酸和琥珀酰CoA，而琥珀酰CoA和甘氨酸缩合反应后可生成维生素B12合成的关键代谢中间体5-氨基乙酰丙酸，然后再经过聚合、重排、环化、甲基化、去碳酸基、钴离子插入以及环缩作用等生成维生素B12。因此，从这个角度讲，维生素B12和丙酸的合成代谢是相辅相成的，具备了维生素B12和丙酸双产物联产的理论基础。费氏丙酸杆菌的胞内代谢产物腺苷钴啉醇酰胺(Ado-cbi)是维生素B12的一个关键代谢中间体，其磷酸化后可与α-吡咯核糖反应生成维生素B12。但是，由于胞内的α-吡咯核糖浓度较低，限制了Ado-cbi的转化速率，并使其在胞内不断积累，因此，α-吡咯核糖是该反应的一个关键限速因子。生产过程中常通过人为添加其结构类似物5,6-二甲基苯并咪唑(DMB)来促进维生素B12的合成。不足之处就是，DMB的添加会影响维生素B12代谢中间体的合成，不利于费氏丙酸杆菌的连续发酵，因此，为了实现维生素B12和丙酸的双产物联产，“中国生物工程杂志，2016,36(4):104-109；过程工程学报，2016,16(2):298-302”中科院过程所王云山研究员提出了“细胞离位转化”的概念，不仅避免了前体物质DMB对发酵的影响，还有助于在分批补料发酵的基础上实现半连续发酵生产。即当发酵进行到某个时间节点时，采用适合的方法(离心或膜分离)将菌体细胞从发酵液中分离出来，转移至另一个反应体系中，加入DMB进行维生素B12的后期合成，而原有发酵体系继续运行。CN101402913A公开了一种批式发酵法生产丙酸联产维生素B12的装置，包括丙酸固定化生产单元和维生素B12的生产单元，两个生产单元通过恒流泵相连接。所述丙酸发酵中，采用甘蔗渣的织物纤维固定化柱将丙酸杆菌进行固定，后续容易将丙酸杆菌和丙酸发酵液分离，但是固定化丙酸杆菌是一个周期长，难度大的步骤，其需要耗费大量的时间，且容易固定失败。
技术实现思路
针对现有技术存在的工业化放大生产难、扩张床填充率低、丙酸杆菌不易与丙酸发酵液分离等问题，本专利技术的目的在于提供一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置及方法，所述方法在膜分离细胞的基础上，耦合固定床层析技术，吸附分离发酵液中的丙酸，解除了丙酸对发酵的反馈抑制作用，并采用再次接种的方法，在分批补料发酵的基础上，实现了维生素B12和丙酸的半连续发酵联产，提高了发酵效率和底物转化率，降低了发酵成本。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术的提供了一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置，所述装置包括发酵单元、膜分离单元、丙酸分离单元和维生素B12的转化单元，所述发酵单元的出料口通过膜分离单元与丙酸分离单元和维生素B12的转化单元的进料口相连接，所述丙酸分离单元的出料口与发酵单元的回流口相连接；所述膜分离单元包括膜分离设备21，所述膜分离设备21包括膜芯，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm。本专利技术中，所述转置通过膜分离设备将发酵液进行分离，而通过选择膜芯的孔径大小，将发酵液中的费氏丙酸杆菌细胞截留浓缩，将含有丙酸的发酵清液分离，不仅不需要将费氏丙酸杆菌进行固定就可以达到分离细胞和发酵清液的目的，还通过分流，将细胞和发酵清液进入两个不同的循环，解除了丙酸对发酵的反馈抑制作用，同时将细胞进行维生素B12的转化生产，而丙酸分离后的废液又可以回流如发酵单元中，进行循环发酵。优选地，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm，例如可以是0.1μm或0.22μm，优选为0.22μm。优选地，所述膜芯为聚醚砜类卷式有机膜、聚醚砜类卷式平板膜或氧化锆类管式陶瓷膜中的任意一种，优选为聚醚砜类卷式有机膜。优选地，所述膜芯的膜面积为不小于0.12m2，例如可以是0.12m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B

【技术特征摘要】
1.一种半连续发酵生产丙酸联产维生素B12的装置，其特征在于，所述装置包括发酵单元、膜分离单元、丙酸分离单元和维生素B12的转化单元，所述发酵单元的出料口通过膜分离单元与丙酸分离单元和维生素B12的转化单元的进料口相连接，所述丙酸分离单元的出料口与发酵单元的回流口相连接；所述膜分离单元包括膜分离设备(21)，所述膜分离设备(21)包括膜芯，所述膜芯的孔径为0.1-0.22μm。2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述膜芯的孔径为为0.22μm；优选地，所述膜芯为聚醚砜类卷式有机膜、聚醚砜类卷式平板膜或氧化锆类管式陶瓷膜中的任意一种，优选为聚醚砜类卷式有机膜；优选地，所述膜芯的膜面积为不小于0.12m2，优选为0.12-3m2；优选地，所述发酵单元包括发酵罐(11)，所述发酵罐(11)的罐体的上半部设置有发酵罐进料口(12)，所述发酵罐(11)的罐顶设置有搅拌装置(13)；优选地，所述丙酸分离单元包括与膜分离单元相连的层析柱(31)，所述层析柱(31)的出料口与发酵罐(11)的回流口相连；优选地，所述层析柱(31)中的填充材料为阴离子交换树脂，优选为ZGD630阴离子交换树脂；优选地，所述层析柱(31)的数量为1-8，优选为2-6，进一步优选为3；优选地，所述维生素B12的转化单元包括与膜分离单元相连的转化反应器(41)，所述转化反应器(41)的上半部设置有转化反应器进料口(12)。3.利用如权利要求1或2所述的装置发酵生产丙酸联产维生素B12的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在发酵培养基中接种费氏丙酸杆菌进行发酵培养；(2)将步骤(1)发酵培养后的培养液通过膜分离装置分离，得到发酵清液和浓缩的菌体细胞；(3)将步骤(2)处理后的发酵清液通过层析柱进行丙酸分离；(4)将步骤(3)丙酸分离后的废液回流入发酵罐中，补加营养物质后，接入新鲜的费氏丙酸杆菌，继续发酵；(5)将步骤(2)处理后的菌体细胞转移至转化反应器中，进行维生素B12的转化生产。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的接种费氏丙酸杆菌为将保存的费氏丙酸杆菌接种到种子培养基中一次活化，再将活化后的费氏丙酸杆菌接种到二级摇瓶种子培养基中二次活化，将二次活化后的费氏丙酸杆菌接种到发酵培养基中发酵培养；优选地，所述种子培养基为：葡萄糖35g/L，玉米浆21g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾4g/L，氯化钴0.005g/L，pH6.8-7.0；优选地，所述活化的温度为25-35℃，优选为28-32℃，优选为30℃；优选地，所述一次活化和二次活化的时间独立地为40-80h，优选为45-55h，进一步优选为48h。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(1)发酵培养的碳源为葡萄糖、甘油，优选为葡萄糖；优选地，步骤(1)所述的发酵培养基为：葡萄糖60g/L，玉米浆41g/L，磷酸二氢钾4.6g/L，氯化钴0.0127g/L，pH6.8-7.0；优选地，步骤(1)所述发酵培养的温度为25-35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃；优选地，步骤(1)发酵培养的搅拌速率为30-100r/min，优选为40-80r/min，进一步优选为50r/min；优选地，步骤(1)发酵培养的pH为6-8，优选为6.8-7.2；优选地，步骤(1)所述发酵的时间为80-90h，优选为82-85h，进一步优选为84h。6.根据权利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，所述膜分离装置中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王自强，徐国霞，魏立全，王云山，苏志国，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11