一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，包括：将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35‑40℃下孵育0‑60min；加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5‑30min内的荧光变化；以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。该方法具有耗时短，操作简单，灵敏度高，结果重现性好，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可在化学品或污染物环境健康风险评价领域有重要应用。
A high-throughput screening method for blood toxic effects of a substance
【技术实现步骤摘要】
一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法
本专利技术涉及一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法，属于化学品环境健康风险评价领域。
技术介绍
新型化学品的环境健康效应得到日益增加的关注，外源物质进入血液并与血浆功能性酶原相互作用是其靶器官毒性调控的关键环节。因此，血液毒性效应评价是化学品环境健康风险评估的重要方面。血管舒缓素-激肽系统(KKS)调控了机体一系列生理学过程，如炎症反应、血压和血管通透性等。血浆激肽释放酶原是KKS系统的重要组成元素，其剪切活化生成血浆激肽释放酶的过程是表征KKS激活的重要方式之一。新型化学品结构复杂，种类繁多，尽管许多化合物存在血液富集的风险，受限于毒性评价体系的筛选通量，新型化学品健康风险评估的滞后已成为限制其安全使用的重要因素。同时，我们亟需灵敏的血液毒性评价方法为新型化学品环境健康风险评估提供重要保障。因此，开发基于血浆激肽释放酶原活化评价化学品血液毒性效应的高灵敏度、高通量方法对化学品的合理管控和安全使用具有重要意义。现有的血浆激肽释放酶原活化检测方法，主要包括蛋白质免疫印迹法、酶联免疫吸附法、酶活性检测法等。蛋白质免疫印迹法和酶联免疫吸附法主要缺点是耗时长，操作复杂，灵敏度低，定量响应范围窄，不能满足高通量检测要求。原有的酶活性检测方法存在灵敏度低，定量响应范围窄，不能满足高通量检测要求等不足。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法。本专利技术采用以下技术方案：一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，包括：将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。在一些实施例中，所述血浆为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆，优选为四周龄SpragueDawley(SD)大鼠血浆。在一些实施例中，所述反应缓冲液为含有0-100μM(例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM)硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。在一些实施例中，血浆与最终反应体系的体积比为1∶(30-300)(例如1∶30、1∶60、1∶90、1∶120、1∶150、1∶180、1∶210、1：240或1∶270)。在一些实施例中，在与待测物质混合之前，所述血浆利用反应缓冲液稀释10-100倍(例如20、30、40、50、60、70、80或90倍)。在一些实施例中，所述酶反应在黑色酶标板中进行。在一些实施例中，所述底物为HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl。在一些实施例中，所述底物在最终反应体系中的浓度为100-150μM(例如110μM、120μM、130μM或140μM)。在一些实施例中，激发波长为395-405nm，发射波长为500-510nm。在一些实施例中，监测荧光变化时，测试间隔为0.5-1min，测试时长为5-30min(例如10min、15min或20min)。与现有的血浆激肽释放酶原活化检测方法(例如蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附法)相比，本专利技术的方法具有耗时短，操作简单，灵敏度高，结果重现性好，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可应用于化学品或污染物环境健康风险评价领域。附图说明图1为本专利技术实施例中血浆与反应体系体积比与酶活的关系；图2为本专利技术实施例中血浆与待测物质孵育时间与酶活的关系；图3为本专利技术实施例中硫酸葡聚糖钠盐暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线；图4为本专利技术实施例中全氟辛基磺酸暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线；图5为本专利技术对比例中全氟辛基磺酸暴露后血浆激肽释放酶反应动力学曲线。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。在本专利技术的说明书中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的参数、步骤等至少包含在根据本专利技术的一个实施例中。因而，在本专利技术的说明书中，若采用了诸如“根据本专利技术的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本专利技术的不同实施例”、“根据本专利技术另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本专利技术说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体特征、参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。本专利技术涉及一种基于血浆激肽释放酶原活化评价物质的血液毒性效应的高通量方法。在原有酶活性检测的基础上，对血浆来源、血浆稀释倍数、反应缓冲溶液组成、待测物质与血浆孵育时间、检测时长、反应体系体积等条件进行优化。本专利技术基于底物HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl检测血浆激肽释放酶活性变化，从而评价化学品对KKS系统的激活能力。此方法具有简单快速，灵敏度高，定量响应范围广，适于高通量检测等优点，可应用于新型化学品环境健康风险评价领域。本专利技术的方法主要包括以下步骤：将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；加入血浆激肽释放酶检测底物HD-Val-Leu-Arg-AFC·2HCl后，监测5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。在本专利技术的实施例中，血浆作为反应体系中血浆激肽释放酶原的来源，血浆可以为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆，优选为四周龄SpragueDawley(SD)大鼠血浆。反应缓冲液为含有0-100μM(例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM)硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。在一个实施例中，首先在黑色96孔酶标板的各孔中，分别加入30-70μL(例如40μL、50μL或60μL)系列浓度梯度的待测物质工作溶液。在加样槽中，采用反应缓冲液将新鲜收集的大鼠血浆稀释10-100倍(例如20、30、40、50、60、70、80、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其特征在于，包括：/n将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；/n加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；/n以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。/n
【技术特征摘要】
1.一种物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其特征在于，包括：
将血浆用反应缓冲液稀释后与待测物质混合，同时设置溶剂对照组，在35-40℃(例如36℃、37℃、38℃或39℃)下孵育0-60min(例如10min、20min、30min、40min或50min)；
加入血浆激肽释放酶检测底物后，监测酶反应在5-30min(例如8min、10min、12min、15min、20min或25min)内的荧光变化；
以测试时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制曲线，经线性拟合得到酶反应速率，将待测物质的酶反应速率与溶剂对照组的酶反应速率进行比较以确定待测物质是否对血浆激肽释放酶原表现出激活效应。
2.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述血浆为大鼠血浆、小鼠血浆或人血浆，优选为四周龄SpragueDawley(SD)大鼠血浆。
3.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，所述反应缓冲液为含有0-100μM(例如10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM或90μM)硫酸锌的磷酸盐缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述物质的血液毒性效应的高通量筛选方法，其中，血浆与最终反应体系的体积比...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，张雨竹，周群芳，江桂斌，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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