一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法技术

本发明专利技术提供了一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，在角蛋白底物处理、制胶、电泳及水解条带显色步骤做了改进，包括(A)将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80‑100℃消煮60‑100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶。本发明专利技术克服了传统酶谱方法底物特异性低、水解条带区分度低、灵敏度低等局限，提供了一种准确、灵敏的检测角蛋白酶活力的酶谱方法。

An enzyme spectrum method for detecting the activity of keratinase

【技术实现步骤摘要】
一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法
本专利技术属于蛋白酶检测领域，具体涉及一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法。
技术介绍
畜禽养殖生产中会产生大量角蛋白(keratin)废弃物，如羽毛、皮毛、角、蹄、爪等。角蛋白是一类硬性纤维状蛋白，它的结构通过二硫键、氢键，盐键和肽键相互作用来维系，不易溶解和消化。传统的物理化学方法处理角蛋白废弃物不仅转化率低，易破坏角蛋白的营养成分，还会造成环境污染。角蛋白降解微生物能够产生一类具有角蛋白水解活性的酶，1963年Nickerson等(NickersonWJ,etal.BiochimicaetBiophysicaActa,1963,77(1):73-86)将具有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。目前发现的多数角蛋白酶具有广泛的底物范围，除了能够降解角蛋白外，还可以降解多种可溶性蛋白质，如胶原蛋白、弹性蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白等。研究显示，用化学合成的对硝基苯胺(para-nitroanilide)作为底物，角蛋白酶主要在P1位点切割疏水性芳香族氨基酸(SilveiraST,etal.JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology,2009,84(3):361-366)。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽、氨基酸及矿物元素，可以用于制造有机肥料以及饲料添加剂，这不仅解决了目前国内农业和畜牧业资源紧缺的难题，还降解了污染源，有利于改善环境。然而，如何快速鉴定与检测角蛋白酶资源，一直是角蛋白酶开发利用的瓶颈。酶谱法(Zymogramtechnique)是用于检测蛋白水解酶的电泳技术，基于特异性底物与丙烯酰胺共聚合来实现酶的特异性检测。随着技术进步，酶谱分析方法又衍生了许多新的技术，包括凝胶酶谱法、原位酶谱分析法、体内酶谱法等。其中，凝胶酶谱法是用于检测蛋白酶活性的最常用手段，其原理大致为：先将目标检测酶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(含特异性底物)电泳分离；在电泳过程中，SDS与目标检测酶结合(可逆结合)，破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥水解作用；电泳结束后，将胶置于Trition中洗脱，由于SDS被Trition结合而去除，从而使酶恢复了活性，在各自的迁移位置发挥水解作用；最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，在蓝色背景下可出现酶的水解白色条带，条带的强弱与酶活性成正比。根据制胶过程中，在分离胶中加入的底物不同，从而能特异性检测不同的酶类。该方法具有检测结果直观、能对目标检测酶定量和定性分析等优点，因此被广泛用于蛋白酶检测
然而，针对于某些特殊蛋白酶的检测(如：角蛋白酶)，凝胶酶谱法存在一些技术上的不足：(1)常用底物特异性低，无法针对性的检测具有广泛水解能力的角蛋白酶；(2)由于角蛋白底物的特殊性，直接加入角蛋白底物，不能与丙烯酰胺有效结合，导致在凝胶背景中，水解条带区分度低、灵敏度低，无法准确的对酶进行定量或定性分析。因此，亟待开发一种准确、灵敏的检测方法，以快速有效的鉴定角蛋白酶资源，加快角蛋白的生物转化，提高角蛋白废弃物的利用率。
技术实现思路
针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；3)进行电泳和水解条带显色；其中：(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。本专利技术通过对角蛋白底物进行消煮处理，有效的清除了角蛋白表面的油脂或其它杂质。本专利技术的专利技术人发现，在消煮时，温度和时间对后续的酶谱反应效果影响较大，温度过高或时间过长易使得角蛋白炭化。在制胶过程中，本专利技术的专利技术人惊奇的发现，通过向制胶溶液加入经(A)处理后的角蛋白底物，再经(B)步骤控制温度和搅拌时间并进行离心制备分离胶，已进一步去除杂质，使角蛋白底物更均匀的与丙烯酰胺共聚结合，可有效提高酶谱试验的区分度与灵敏度。如本专利技术的实施例所示，利用本专利技术酶谱方法对角蛋白酶进行检测，水解条带辨识度强，可轻易判别目标酶的活性；更重要的是还可以进行目标酶的酶学特性检测。本领域技术人员均知，在对酶进行酶谱检测时，水解条带的辨识度的强弱是至关重要的。如本专利技术的一个实验例所示，现有技术在利用酶谱法对角蛋白酶进行检测时，所得水解条带辨识度极差，最多只能对目标酶的大小进行粗略估计，难以进行酶活的对比，更无法对目标酶的酶学特性进行检测。因此，应当理解，本专利技术所得的技术效果对于角蛋白酶的检测领域而言，是极其显著的，对角蛋白废弃物资源高值化综合利用具有巨大的应用价值。优选的，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g离心15min收集角蛋白沉淀，用去离子水重悬，清洗沉淀，于2000g离心15min收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。利用上述方法处理角蛋白底物，可以使得检测效果更好。优选的，将角蛋白沉淀晾干后，再进行研磨，过100目筛。本专利技术的专利技术人发现，角蛋白底物的预处理对于后续的酶谱检测较为重要，通过将角蛋白沉淀晾干后再进行研磨过100目筛，可增强水解条带的辨识度。优选的，所述有机溶剂为乙醇。本专利技术的专利技术人发现，利用二甲基亚砜或乙醇处理角蛋白底物，可有效的去除角蛋白表面的油脂或其它杂质。特别的，利用乙醇处理时，不仅效果优秀，且试剂的毒性小、成本低，利于推广应用。优选的，配置所述质量浓度为12％的分离胶时，其方法为：依次加入ddH2O3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/LpH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS50ul，再加入由(A)处理后的角蛋白底物0.05-0.1g，于室温下以100r/min的转速搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液。优选的，在电泳时，酶样品按体积比1:3与上样缓冲液混合；按5-10ul/孔混合样品上样，于4℃条件下，进行SDS-PAGE电泳，80-100V恒压跑至分离胶和浓缩胶交界处后改为170–200V恒压，直至溴酚蓝跑出胶外；所述上样缓冲液的成分为：0.32％Tris-HCl6.4ml，4％pH7.2SDS8ml，16％甘油3.2ml，溴酚蓝0.024g，ddH2O2.4ml。优选的，电泳结束后，将凝胶置于洗脱液中振荡洗脱2次，每次20-40min；然后，用漂洗液漂洗2次，每次10-20min；接着，将凝胶置于孵育液中37℃孵育24–40h；孵育结束后经染色液于室温染色2-4h或于4℃染色过夜；最本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：/n1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；/n2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；/n3)进行电泳和水解条带显色；/n其特征在于：/n(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；/n(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；/n所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测角蛋白酶活力的酶谱方法，其包括：
1)角蛋白底物预处理，清除羽毛角蛋白上的杂质；
2)角蛋白胶谱的制备，包括制备分离胶和浓缩胶；
3)进行电泳和水解条带显色；
其特征在于：
(A)步骤1)中，将10g角蛋白底物和500ml有机溶剂加入回流冷凝装置中，于80-100℃消煮60-100min；用两倍体积经4℃预冷的丙酮沉淀角蛋白；离心收集角蛋白沉淀，清洗后于4℃晾干；
(B)在制备分离胶时，加入由(A)处理所得角蛋白底物，使得其质量百分含量为0.1％，然后于室温下以100r/min的速度搅拌1h，离心取上清，进行配置质量浓度为12％的分离胶；
所述角蛋白底物包括羽毛；所述有机溶剂包括二甲基亚砜、乙二醇中的一种。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用丙酮沉淀角蛋白后，于2000g离心15min收集角蛋白沉淀，用去离子水重悬，清洗沉淀，于2000g离心15min收集沉淀，重复清洗一次后于4℃晾干。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将角蛋白沉淀晾干后，再进行研磨，过100目筛。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配置所述质量浓度为12％的分离胶时，其方法为：依次加入ddH2O3.3ml，30％丙烯酰胺溶液4ml，1.5mol/LpH＝8.8的Tris溶液2.5ml，10％SDS50ul，再加入经(A)处理所得角蛋白底物0.05-0.1g，于室温下以100r/min的速度搅拌1h，然后将溶液在2000g离心15min，取上清，按10ml分离胶中加入10％过硫酸铵100ul以及N,N,N',N'-四甲基二乙胺4ul的体积比例制备成混合溶液。


6.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈璐，孙怀强，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51