本发明专利技术公开了一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，试剂盒，包括：融合蛋白‑抗原‑抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA‑2a抗体，IA‑2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA‑512抗体；制备方法通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，再利用细胞转化得到荧光素酶—抗原融合蛋白；再通过裂解基因重组细胞，纯化，捕捉获得融合蛋白‑抗原‑抗体复合物；再加入荧光素酶底物，检测荧光强度；本发明专利技术通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。
A kit for detection of combined antibodies in type I diabetes mellitus and its preparation
【技术实现步骤摘要】
一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及自身免疫检测领域，特别是一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
I型糖尿病(IDDM)是一种自体免疫疾病，机体受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素诱发而产生异常自身体液和细胞免疫应答，导致胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少，一旦发病需要依赖外源性胰岛素补充以维持生命，所以I型糖尿病又称胰岛素依赖性糖尿病。对I型糖尿病的诊断主要通过检测其自身免疫性抗体，抗体主要包括以下几种：谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)、胰岛细胞抗体(ICA)、酪氨酸磷酸酶抗体(IA-2a、IA-2b)及胰岛素自身免疫性抗体(IAA)。现有的Ⅰ型糖尿病自身免疫检测方法如下所述：ICA(抗胰岛细胞抗体)：①间接免疫荧光法；②组织化学染色法；③免疫沉淀化学法；④ELISA法。GAD(谷氨酸脱羧酶抗体)：①免疫沉淀酶活性法；②放射免疫法；③ELISA法；④间接免疫荧光法；⑤化学发光法。ICA512/IA2ab(抗酪氨酸磷酸酶抗体)：①ELISA法；②放射配体分析法(RLA)；③35S标记的放射免疫沉淀法。IAA(抗胰岛素自身抗体)：①放免法；②ELISA法。但是现有的检测方法具有如下问题：ELISA法：对于酶的活性和灵敏度要求很高，其特异性取决于抗原制备的优劣；且其结合物制备尚未标准化，这使得实验结果的可重复性不高，需要进行多次检测。另外，若抗原及酶结合物浓度低，最后吸光度值太小，易出现假阴性。多数国家的临床检测已放弃ELISA法，使用放射免疫法(RIA法)。放射免疫法：具有许多其它分析方法无可比拟的优点。它既具有免疫反应的高特异性，又具有放射性测量的高灵敏度，并且样品用量少，常可测至皮摩尔量。但本方法有时会出现交叉反应、假阳性反应、组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐，有时会影响结果等。市场需要一种对Ⅰ型糖尿病的诊断有高特异性和高敏感性的检测试剂盒，本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒及其制备方法，通过联合检测提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性和灵敏度，减少了检查次数，减少了漏判率。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，缓冲液包括：磷酸盐吐温缓冲液，磷酸盐缓冲液，荧光素酶底物检测缓冲液。一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；步骤二，质粒转化与扩繁提取，将重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，进行大肠杆菌菌种扩繁，再使用质粒大提试剂盒提取重组质粒；步骤三，获取融合蛋白，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达，裂解基因重组细胞，收集细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；步骤四，纯化重组融合蛋白，利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；步骤五，使用蛋白A/G琼脂糖酶标板捕捉融合蛋白-抗原-抗体复合物，步骤六，抗原抗体免疫反应，反应体系包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，PBS缓冲液，PBST缓冲液，荧光素酶底物，标准品，检测样品血清。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，载体质粒为PA0815载体质粒。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，荧光素酶基因为Ranilla荧光素酶基因。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，感受态大肠杆菌的菌种为基因工程转化的含GAD65的重组大肠杆菌。前述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，通过细胞转化将融合载体导入哺乳细胞系统中的步骤包括：1)将T293细胞经过扩增培养40-60h，和细胞传代培养40-60h；2)使用重组质粒进行磷酸钙转染，继续培养约48h后，使用PBS缓冲液收集细胞。本专利技术的有益之处在于：GAD65抗体、IA-2a抗体、IA-2b抗体、IAA、GADA抗体和ICA-512抗体这六种抗体的联合检测能够提高Ⅰ型糖尿病的检测的特异性(可达99.6％)和敏感性(可达98％)，对极早预报Ⅰ型糖尿病具有重要的意义；本专利技术采用基因重组荧光素酶—多抗原融合蛋白抗体检测技术，减少了检查次数，提高了灵敏度，大大减少了漏判率。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作具体的介绍。一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。GAD-65抗原基因序列是：GCCAAACAGAAAGGGTTTGTTCCTTTCCTCGTGAGTGCCACAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；所述抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。/n
【技术特征摘要】
1.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：融合蛋白-抗原-抗体复合物，缓冲液，荧光素酶底物，标准品；所述抗体包括：GAD65抗体，IA-2a抗体，IA-2b抗体，IAA抗体，GADA抗体和ICA-512抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白-抗原-抗体复合物通过将荧光素酶基因与抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与样本血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白-抗原-抗体复合物；多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列。
3.根据权利要求1所述的一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：磷酸盐吐温缓冲液，磷酸盐缓冲液，荧光素酶底物检测缓冲液。
4.一种用于Ⅰ型糖尿病联合抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，构建荧光素酶基因与抗原基因的融合载体，
选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列，进行PCR扩增，在kpnl位点-GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；所述多抗原基因的目的序列包括：GAD-65抗原基因序列，IA-2a抗原基因序列，IA-2b抗原基因序列，IAA抗原基因序列，GADA抗原基因序列，ICA-512抗原基因序列；
将获得的目的片段与载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐东起，魏瑾，周扬，
申请(专利权)人：杭州北角医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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