一种用于任意核酸编辑的组合物及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标底物互补，另一部分具有核酸二级结构；组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割DNA或者RNA底物。本发明专利技术中，寡核苷酸探针上的二级发卡结构(茎‑环结构)可以直接被核酸内切酶分子识别，形成复合物分子。该复合物分子碰撞靶标的底物的概率将大于探针和酶两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概率，从而提高基因编辑效率。

A composition and method for arbitrary nucleic acid editing

【技术实现步骤摘要】
一种用于任意核酸编辑的组合物及方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种用于任意核酸编辑的组合物及方法。
技术介绍
“人类基因组计划”的完成，为阐明基因组功能以及在遗传变异和生物表型之间建立因果联系提供了可能，而高效、简便和精准的基因编辑系统是将这一可能付诸实现的重要工具。许多以此为目标的基因编辑系统被开发和应用，如锌指核糖核酸酶(ZFN)系统、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)系统和成簇规律间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)系统等。CRISPR-Cas系统作为重要的基因编辑工具具有设计简单、切割效率高等特点，已被广泛用于细胞、动物和植物的基因组DNA编辑，并在临床和农业应用上表现出巨大的潜力，堪称基因编辑技术发展史上伟大的里程碑。但是，CRISPR-Cas系统依旧有待改进的空间。首先，几乎所有目前文献报导的CRISPR-Cas系统都依赖PAM(protospaceradjacentmotif)序列进行定位，而PAM序列有固定的碱基搭配模式，从而限制了CRISPR-Cas系统在人类基因组中的锚定范围。尽管已有研究团队利用扩展Cas蛋白家族谱以及PAM序列种类的策略部分克服了这一限制，但随着对人类基因组30亿个碱基上各种基因功能探索欲望的增强，该不利因素将愈发难以忽略。其次，作为CRISPR-Cas系统中关键的Cas9或Cas12蛋白，二者的体积较大，不利于在体内进行包装和运输，这样就对将来的基因治疗药物设计提出较高的挑战。尽管已有研究团队开发出了更小的Cas蛋白，如CasX和Cas14，但它们仍然由约1000个氨基酸组成，大小在100kDa左右，该体型毫无疑问还需要进一步缩小。另外，文献报道Cas9蛋白可以切割DNA序列，Cas13蛋白可以切割RNA序列，尚没有一种Cas蛋白可以同时很好地切割DNA和RNA，这可能会限制将来病毒击杀等方面的应用。2016年，本课题组报道了另一种基因编辑工具系统，命名为结构导向核酸酶(structure-guidednuclease，SGN)，后文称之为第一代SGN。当时，本课题组将一种古细菌来源的flap核酸内切酶1(AfuFEN1)用于基因编辑，将AfuFEN1与FokI的切割域(Fn1)融合构建了SGN，通过AfuFEN1识别靶基因与向导DNA探针(guideDNA，简称gDNA)之间形成的3’flap结构而锚定靶基因，并通过Fn1切割靶基因。SGN具有如下特点，首先，3’flap结构的形成不受靶基因序列的限制，因此理论上SGN可以切割基因组DNA中的任何位点。其次，SGN由约500个氨基酸组成，大小70kDa左右，体积比Cas蛋白小，更适合体内递送。除此之外，在SGN处理的细胞基因组DNA中观察到大片段缺失突变形式，其与个别碱基突变(Cas蛋白产生的突变类型)相比更容易使靶基因编码的蛋白完全沉默。上述特性使得SGN有希望成为一种新的基因组编辑工具或基因治疗工具。但美中不足的是，第一代SGN的编辑效率较低，在斑马鱼细胞中仅为1-10％，我们研究认为，第一代SGN效率较低的原因是靶标DNA需要先被gDNA结合形成3'flap结构后，才能被SGN结合，这样两步反应大大降低了SGN的编辑效率。并且，SGN中起切割DNA作用的Fn1结构域靶向特异性相对较差，Fn1是一种非特异性内切酶，在细胞中一旦随机碰撞到非靶标区域，就会引发切割反应，是导致基因组DNA中脱靶的关键原因。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有CRISPR-Cas系统和第一代SGN系统技术的上述不足，提供一种无靶基因序列限制、体积小巧、反应效率和特异性更好的组合物及方法。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现:一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有核酸二级结构；该探针上的二级结构可以直接被核酸内切酶分子识别形成复合物分子，该复合物分子碰撞靶标核酸底物的概率将大于两个独立扩散的分子同时碰撞靶标核酸底物的概率，从而提高编辑效率。组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割DNA或者RNA底物。所述的组合物，优选包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；寡核苷酸探针数量包括但不限于1条；组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子即可以识别所述的寡核苷酸探针的茎-环核酸二级结构从而与探针结合，还可以切割靶标核酸底物。所述的组合物，进一步优选包括两个主要组分：组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸二级结构；寡核苷酸探针数量为1条或2条；组分B：AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、HomoSapiensFEN中任意一种的部分功能域或全酶片段。所述的茎-环核酸二级结构是指核酸分子中存在的反向重复序列，由于互补碱基间的氢键配对，长链区段可以回折形成的一种二级结构，如图1所示。在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述靶多核苷酸是RNA或DNA,优选是基因组DNA和转录组mRNA，所述的基因组和转录组mRNA优选是哺乳动物基因组和转录组(包括人类基因组和转录组)、大肠杆菌基因组和转录组、斑马鱼基因组和转录组或植物基因组和转录组。在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述寡核苷酸探针与靶标核酸底物互补部分的长度在11nt以上。在一个具体实施例中，所述的靶多核苷酸编辑方法中，所述一对核苷酸探针长度方向既可以是3’端与3’端相对，也可以5’端与5’端相对。在一个具体实施例中，所述的核酸内切酶分子含有核定位信号。在一个具体实施例中，所述的核酸内切酶分子含有核导出信号。本专利技术所述的组合物在核酸编辑中的应用，所述的核酸编辑不包括以疾病诊断和或治疗为目的的核酸编辑。一种对任意靶多核苷酸编辑方法，根据靶多核苷酸，设计并合成本专利技术所述的寡核苷酸探针，向含有靶多核苷酸的体系中加入所述的寡核苷酸探针和所述的核酸内切酶分子，所述的核酸内切酶分子识别寡核苷酸探针的二级结构从而与探针结合形成复合物，该复合物识别靶多核苷酸并对其实现切割。所述的靶多核苷酸为DNA或RNA，优选是基因组DNA和转录组mRNA，所述的基因组和转录组mRNA优选是哺乳动物基因组和转录组(包括人类基因组和转录组)、大肠杆菌基因组和转录组、斑马鱼基因组和转录组或植物基因组和转录组。当所述的靶多核苷酸为基因组DNA和转录组mRNA时，寡核苷酸探针的条数为1条或以上。有益结果：第一，本专利技术中，寡核苷酸探针上的二级发卡结构(茎-环结构)可以直接被核酸内切酶分子识别，形成复合物分子。该复合物分子碰撞靶标的底物的概率将大于探针和酶两个独立扩散的分子同时碰撞靶标底物的概本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，其特征在于包括两个主要组分：/n组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有核酸二级结构；/n组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子既能够识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还能够切割靶标核酸底物。/n

【技术特征摘要】
1.一种对任意核酸实施靶向切割的组合物，其特征在于包括两个主要组分：
组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有核酸二级结构；
组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子既能够识别所述的寡核苷酸探针的核酸二级结构从而与探针结合，还能够切割靶标核酸底物。


2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于包括两个主要组分：
组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标底物互补，另一部分具有茎-环核酸结构；寡核苷酸探针数量包括但不限于1条；
组分B：核酸内切酶分子：该核酸内切酶分子既能够识别所述的寡核苷酸探针的茎-环核酸结构从而与探针结合，还能够切割靶标核酸底物。


3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于包括两个主要组分：
组分A：寡核苷酸探针：寡核苷酸探针由两部分组成，一部分与靶标核酸底物互补，另一部分具有茎-环核酸结构；寡核苷酸探针数量为1条或2条；
组分B：AfuFEN、PfuFEN、MjaFEN、MthFEN、HomoSapiensFEN中任意一种的部分功能域或全酶片段。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于所述寡核苷酸探针与靶标核酸底物互补部分的长度在11nt以上。


5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐澍，周国华，邹秉杰，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32