一种体外高效扩增NK细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种利用基因修饰的K562滋养细胞扩增NK细胞的方法，利用慢病毒转载系统将IL‑21、IL‑27和CD70基因同时转染K562细胞，获得稳定表达IL‑21、IL‑27和CD70蛋白的K562工程细胞，将该细胞灭活后与PBMC混合进行培养，在低浓度IL‑2存在下即可在无血清培养基中扩增NK细胞，扩增倍数在800‑1100左右，且该NK细胞有效纯度达到91%，IFN‑γ的分泌量是普通方法培养出的NK细胞的5倍，在效靶比10:1的情况下该NK细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤率达到88.5%，比常规条件下培养的NK细胞的杀伤率高出约20%，说明此方法培养出的NK细胞具有较高的杀伤能力。

A method of high efficient expansion of NK cells in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种体外高效扩增NK细胞的方法
本专利技术属于细胞扩增领域，具体涉及一种体外高效扩增NK细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK细胞）是一类不同于T、B细胞的特殊淋巴细胞群体。NK细胞对靶细胞的杀伤表现为一种速发效应（immediateeffect），无须预先致敏，与靶细胞混合后4小时内即发挥杀伤效应。NK细胞不仅可以无需主要组织相容性复合物（MHC）限制性直接杀伤靶细胞，还可以通过分泌IFN-γ和TNF-α等细胞因子来干扰病毒复制和进一步活化吞噬细胞，也可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性效应（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）杀伤被特异性IgG包被的瘤细胞。因此，NK细胞在抗感染及抗肿瘤治疗中具有十分重要的作用。然而，NK细胞作为淋巴细胞中的稀有细胞亚群，在人的外周血淋巴细胞中只占5%-15%，因此需要在体外对其进行扩增然后回输到体内。体外扩增的NK细胞在临床应用中存在的问题是如何获得大量的可杀死肿瘤细胞的高纯度NK细胞。DunneJ等人通过IL-2或IL-15刺激外周血淋巴细胞或以磁珠分离而得的细胞而使其增殖。根据文献的报道，所述增殖在十倍左右，因此需要准备大量的外周血单核细胞（PBMC)。另有报道称通过体外添加细胞因子（IL-21、IL-15等）的方法进行NK细胞培养，但扩增能力仅有200-500倍，NK细胞纯度不太稳定，分布在40%-80%，难以满足临床的需求。ImaiC等人，将整合有4-1BBL基因和IL-21基因的K562细胞和PBMC混合培养后得到的NK细胞数量和纯度都有较大幅度提升，但是杀伤能力有限。
技术实现思路
针对目前缺少高效扩增NK细胞方法、杀伤能力低的问题，本专利技术提供一种利用基因修饰的K562滋养细胞扩增NK细胞的方法，能高效获得NK细胞，且纯度高，杀伤能力强。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种表达IL-21、IL-27和CD70蛋白的K562工程细胞，所述IL-21、IL-27和CD70蛋白均在细胞膜表面表达。一种上述K562工程细胞的制备方法，包括以下步骤：利用携带IL-21、IL-27和CD70基因的病毒载体转染K562细胞，获得同时表达IL-21、IL-27和CD70蛋白的K562工程细胞。所述IL-21和IL-27基因序列的5’端均添加信号肽，3’端均添加跨膜区基因。所述信号肽选自OSM、VSV-G、trypsinogen-2、IL-2、CD8的信号肽；优选为CD8信号肽。所述跨膜区选自CD3epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1或LAG-3的跨膜区；优选为CD8跨膜区。所述病毒载体可以为腺病毒、慢病毒；优选为慢病毒。一种利用上述K562工程细胞扩增NK细胞的方法，包括以下步骤：（1）将K562工程细胞辐照灭活后获得K562滋养细胞；（2）分离并提取血液中的单个核细胞（PBMC）；（3）在单个核细胞中加入K562滋养细胞、IL-2培养，第7天时再次加入K562滋养细胞，培养15天，收集细胞。步骤（1）中，所述灭活步骤为：100Gy剂量的放射线辐照细胞20-30min。步骤（2）中，所述血液可以为外周血或脐带血。步骤（3）中，所述单个核细胞的浓度为1.5×106/mL。步骤（3）中，所述IL-2终浓度为200U/mL。步骤（3）中，首次加入K562滋养细胞与单个核细胞的数量比为1:2-5，再次加入K562滋养细胞与初始单个核细胞的数量比为1:10-20。步骤（3）中，所述培养条件为37℃、5%CO2、100%湿度。本专利技术具有以下优点：本专利技术获得的K562滋养细胞膜表面表达的蛋白与NK细胞的激活、增殖及杀伤功能密切相关：IL-21是传统的NK细胞培养因子，可以促进NK细胞的增殖、分化及产生IFN-γ。IL-27可以诱导细胞表达IL-12R，协同IL-12诱导细胞产生IFN-γ，也可以直接促进NK细胞分泌IFN-γ。CD70是CD27的配体，CD27在NK细胞表面表达通过与配体的相互作用而诱导NK细胞活化及IFN-γ产生，还可以可通过诱导IFN-γ产生而增强NK细胞毒活性。本专利技术通过分子克隆的方法构建基因修饰的K562滋养细胞，使其可以同时在细胞膜表面表达IL-21、IL-27和CD70。将该细胞灭活后与PBMC混合进行培养，在低浓度IL-2存在下即可在无血清培养基中扩增NK细胞，扩增倍数在800-1100左右，且该NK细胞纯度达到91%，IFN-γ的分泌量是普通方法培养出的NK细胞的5倍，在效靶比10:1的情况下该NK细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤率达到88.5%，比常规条件下培养的NK细胞的杀伤率高出约20%，说明此方法培养出的NK细胞具有较高的杀伤能力。而且，含血清培养基中的血清多来自于牛血清，成分比较复杂，容易引入牛的病原体，而且如果牛蛋白粘附于细胞表面回输人体容易引起免疫反应。附图说明图1为经基因修饰的K562工程细胞其表面表达IL-21、IL-27、CD70结构示意图；图2为经基因修饰的K562工程细胞其细胞表面IL-21（A）、IL-27（B）、CD70（C）的表达情况；图3为NK细胞增殖曲线，其中，NK1为使用本专利技术方法培养得到的NK细胞，NK2为使用经典方法培养得到的NK细胞；图4为NK细胞表面标记CD3-、CD16+、CD56+分析；图5为NK细胞对肝癌细胞HepG2的杀伤，其中，NK1为使用本专利技术方法培养得到的NK细胞，NK2为使用经典方法培养得到的NK细胞；图6为NK细胞细胞因子IFN-γ的分泌情况，其中，NK1为使用本专利技术方法培养得到的NK细胞，NK2为使用经典方法培养得到的NK细胞。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1基因修饰的K562滋养细胞的构建（1）构建慢病毒载体：按照CD8asp-IL21-CD8TM-T2A-CD8asp-IL27-CD8TM-IRES-CD70的顺序合成目的基因，序列如SEQIDNO:1所示，并且在5’端添加SpeI酶切位点（actagt），3’端添加NotI酶切位点（gcggccgc）。双酶切后转入同样双酶切的慢病毒骨架质粒（pHR-mCheery）中，获得含IL-21、IL-27和CD70基因的慢病毒骨架质粒。IL-21和IL-27序列的5’端分别添加CD8的信号肽(MALPVTALLLPLALLLHAARP)基因、3’端分别添加CD8的跨膜区基因，使这两个蛋白可以锚定在细胞膜上；CD70本身跨膜蛋白，可以锚定在细胞膜上；（2）骨架质粒与包装质粒按0.89:0.11:1(质量比)混合，共转染293FT细胞，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达IL-21、IL-27和CD70蛋白的K562工程细胞，其特征在于，所述IL-21、IL-27和CD70蛋白均在细胞膜表面表达。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达IL-21、IL-27和CD70蛋白的K562工程细胞，其特征在于，所述IL-21、IL-27和CD70蛋白均在细胞膜表面表达。


2.一种如权利要求1所述的K562工程细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用携带IL-21、IL-27和CD70基因的病毒载体转染K562细胞，获得同时表达IL-21、IL-27和CD70蛋白的K562工程细胞。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述IL-21和IL-27基因序列的5’端均添加信号肽，3’端均添加跨膜区基因。


4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述信号肽选自OSM、VSV-G、trypsinogen-2、IL-2、CD8的信号肽；优选为CD8信号肽；
所述跨膜区选自CD3epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1或LAG-3的跨膜区；优选为CD8跨膜区。


5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述病毒载体可以为腺病毒、慢病毒；优选为慢病毒。

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晨，谭毅，
申请(专利权)人：山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37