一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种精准杀伤肿瘤的CAR‑T细胞的制备及其用途。具体地，本发明专利技术提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。工程化免疫细胞可选择性杀伤肿瘤细胞，比如CXCL12或MUC1高表达的肿瘤细胞，并且本发明专利技术的CAR‑T细胞对其杀伤效果很显著。

The preparation and application of car-t cell for killing tumor accurately

【技术实现步骤摘要】
一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途
本专利技术属于生物
具体地，本专利技术涉及一种精准杀伤肿瘤的CAR-T细胞的制备及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体基因修饰T(chimericantigenreceptorgene-modifiedT，CAR-T)细胞疗法是当前肿瘤免疫细胞治疗的研究热点及重点。它将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤机制有机结合，使CAR-T能特异性地识别肿瘤细胞，还能不依赖MHC的限制性而直接杀伤肿瘤细胞。有研究表明，它在血液系统肿瘤治疗已经取得重要进展，并且正在逐渐延伸到实体瘤的临床治疗中，有望攻克实体瘤治疗的难关。嵌合型抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)是一种融合分子，由胞外抗原结合区，跨膜区及与T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)的胞内信号区构成。其中胞外抗原结合区是赋予CAR-T细胞识别特定肿瘤抗原的关键部分，它源于抗体的抗原结合基序，具备连接VH和VL序列构建单链可变区(singlechainfragmentvariable，ScFv)的作用。这决定了重组CARs与抗原的结合可以不依靠MHC的递呈，这可以避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；跨膜区连接胞外抗原结合区和胞内信号区，一般由二聚体膜蛋白组成，主要包括CD3ζ、CD4、CD8、CD28等，能将CARs结构锚定于T细胞膜上。胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(immune-receptortyrosine-basedactivationmotifs，ITAM)，CARs接受肿瘤相关抗原(tumor-associatedangtige，TAA)信息后，不直接传递信号，而是通过CD3或高亲和性受体FcRI的胞内区使T细胞活化，活化后的T细胞分泌孔蛋白、颗粒酶及细胞因子协同作用杀死肿瘤细胞，发挥效应功能。免疫细胞治疗技术中的CAR-T疗法近年来发展非常迅速，通过基因改造的技术给T细胞加入嵌合抗体后，其靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的T细胞有所提高。CAR-T技术不仅可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，还可以每次只靶向一种类型的肿瘤抗原，为肿瘤治疗带来了新的希望。前列腺癌(prostatecancer，PC)是危害人类健康的恶性肿瘤之一，前列腺癌是全球第二大常见癌症，也是全球男性癌症死亡的第五大原因。每年诊断出一百万个新PC病例，死亡率有逐年升高趋势，目前排男性恶性肿瘤发病率的第6位。前列腺癌是一种好发于中老年男性的上皮性恶性肿瘤，由于该病早期缺乏典型症状，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳治疗时机，前列腺癌的早期诊断困难，病程发展快，转移发生早，预后极差。因此，近年来新兴的CAR-T疗法成为前列腺癌治疗的新希望。然而，CAR-T疗法固然有效，但也存在不少亟待解决的问题，其中一大挑战就是CAR-T细胞向肿瘤组织中的归巢问题。因此，本领域迫切需要开发一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞靶向归巢、精准杀伤肿瘤的治疗目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的嵌合抗原受体T细胞，从而实现CAR-T细胞靶向归巢、精准杀伤肿瘤的治疗目的。本专利技术的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为T细胞。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR含有靶向MUC1的抗原结合结构域。在另一优选例中，所述抗原结合结构域为抗体或抗原结合片段。在另一优选例中，所述抗原结合片段是Fab或scFv或单结构域抗体sdFv。在另一优选例中，所述CAR的结构如式I所示：L-S-H-TM-C-CD3ζ(I)式中，所述“-”为连接肽或肽键；L为无或信号肽序列；S为靶向MUC1的抗原结合结构域；H为无或铰链区；TM为跨膜结构域；C为共刺激信号分子；CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。在另一优选例中，所述靶向MUC1的抗原结合结构域包括Siglec-9的胞外段或靶向MUC1的抗体单链可变区序列。在另一优选例中，所述Siglec-9的胞外段的氨基酸序列选自下组：(a)如SEQIDNO:1氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQIDNO:1氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有90％以上(较佳地≥95％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。在另一优选例中，编码所述Siglec-9的胞外段的核苷酸序列选自下组：(a)核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列与SEQIDNO:2所示序列的同源性≥70％(较佳地≥80％、≥90％、≥95％或≥98％)，且具有靶向或结合于MUC1活性的多核苷酸；(c)如SEQIDNO:2所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-6个)核苷酸，且具有靶向或结合于MUC1活性的多核苷酸。在另一优选例中，所述Siglec-9的胞外段为人源。在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8a、CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述L为CD8a来源的信号肽。在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8a、CD28、CD137、或其组合。在另一优选例中，所述H为CD8a来源的铰链区。在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD3epsilon、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD137、CTLA-4、PD-1、LAG-3、或其组合。在另一优选例中，所述TM为CD8a来源的跨膜区。在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、DAP10、CDS、ICAM-1、或其组合。在另一优选例中，所述C为4-1BB来源的共刺激信号分子。在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。在另一优选例中，所述CXCR4的氨基酸序列如SEQIDNO.:4所示。本专利技术第二方面提供了一种制备本专利技术第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：(A)提供一待改造的免疫细胞；和(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。/n

【技术特征摘要】
1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4。


2.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)提供一待改造的免疫细胞；和
(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向MUC1的嵌合抗原受体CAR和CXCR4，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。


3.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。


4.如权利要求3所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。


5.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用...

【专利技术属性】
技术研发人员：江文正，阮丹阳，张利，周滢，张红梅，刘明耀，席在喜，
申请(专利权)人：华东师范大学，上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31