包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质制造技术

本发明专利技术涉及包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质，和用于产生提取的植物脂质的方法。

【技术实现步骤摘要】
包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质本申请是申请日为2014年12月18日，申请号为201410796297.7，题目为“包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及包含二十二碳六烯酸的提取的植物脂质，和用于产生提取的植物脂质的方法。
技术介绍
ω-3长链多元不饱和脂肪酸(LC-PUFA)现在被广泛公认为是用于人和动物健康的重要化合物。这些脂肪酸可从膳食来源中获得或者可通过转化亚油酸(LA，18:2ω6)或α-亚麻酸(ALA，18:3ω3)脂肪酸来获得，这两种脂肪酸均被认为是人膳食中的必需脂肪酸。虽然人和很多其它脊椎动物能够将从植物来源获得的LA或ALA转化为C22，但他们以极低的速率进行此转化。此外，最现代的社会具有不平衡的膳食，其中至少90％多元不饱和脂肪酸(PUFA)为ω6脂肪酸，而不是被认为理想的4∶1比率或更少的ω6：ω3脂肪酸(Trautwein，2001)。人的LC-PUFA如二十碳五烯酸(EPA，20：5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA，22：6ω3)的直接膳食来源大部分来自鱼或鱼油。因此，健康专业人员推荐在人膳食中常规地包括含有显著水平的LC-PUFA的鱼。逐渐地，鱼来源的LC-PUFA油并入例如食物产品和婴儿配方中。然而，由于全球和国家渔业的下降，需要这些有利的增强健康的油的替代来源。与动物相反，显花植物缺乏合成具有长于18个碳的链长度的多元不饱和脂肪酸的能力。具体地说，农作物和园艺植物连同其它被子植物不具有合成源于ALA的较长链ω3脂肪酸如EPA、二十二碳五烯酸(DPA，22：5ω3)和DHA所需要的酶。因此，植物生物技术中的重要目标为对产生大量LC-PUFA的农作物植物进行工程化，从而提供这些化合物的替代来源。LC-PUFA生物合成路径LC-PUFA在有机体如微藻、苔藓和真菌中的生物合成通常作为一系列氧依赖性去饱和和延伸反应(图1)出现。在这些有机体中产生EPA的最常见路径包括Δ6-去饱和、Δ6-延伸和Δ5-去饱和(称为Δ6-去饱和路径)，而较不常见的路径使用Δ9-延伸、Δ8-去饱和和Δ5-去饱和(称为Δ9-去饱和路径)。这些连续的去饱和反应和延伸反应可以ω6脂肪酸底物LA(如图1的左上部分(ω6)示意性示出的)或者ω3底物ALA开始，直到EPA(如图1的右下部分(ω3)示出的)。如果对ω6底物LA进行初始Δ6-去饱和，三种酶的系列的LC-PUFA产物将为ω6脂肪酸ARA。LC-PUFA合成有机体可使用如图1的Δ17-去饱和酶步骤所示的ω3-去饱和酶将ω6脂肪酸转化为ω3脂肪酸，以用于将花生四烯酸(ARA，20：4ω6)转化为EPA。ω3-去饱和酶家族的一些成员可作用于范围为LA至ARA的多种底物。植物ω3-去饱和酶常明确催化LA至ALA的Δ15-去饱和，而真菌和酵母ω3-去饱和酶对于ARAΔ17-去饱和为EPA可为特异的(Pereira等，2004a；Zank等，2005)。一些报道表明可存在非特异性ω3-去饱和酶，其可将各种各样的ω6底物转化为其对应ω3产物(Zhang等，2008)。在这些有机体中，通过EPA的Δ5-延伸来产生DPA，然后通过Δ4-去饱和来产生DHA(图1)，从而进行EPA至DHA的转化。与此相反，哺乳动物使用所谓的“Sprecher”路径，所述路径通过独立于Δ4-去饱和酶的三个独立反应将DPA转化为DHA(Sprecher等，1995)。通常可见于植物、苔藓、微藻和低等动物如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中的前端去饱和酶主要接受与磷脂酰胆碱(PC)底物的sn-2位置酯化的脂肪酸底物。这些去饱和酶因此被称为酰基-PC、脂质连接的前端去饱和酶(Domergue等，2003)。相比之下，高等动物前端去饱和酶通常接受酰基-CoA底物，其中脂肪酸底物连接至CoA，而不是PC(Domergue等，2005)。已知一些微藻去饱和酶和一种植物去饱和酶使用与CoA酯化的脂肪酸底物(表2)。每个PUFA延伸反应由通过多组分蛋白质复合物催化的四个步骤组成：首先，缩合反应引起来自丙二酰-CoA的2C单元添加至脂肪酸，从而引起β-酮酯酰中间体的形成。然后，这通过NADPH还原，然后脱水以产生烯酰基中间体。最终对此中间体进行第二次还原以产生延伸的脂肪酸。通常认为，这四个反应的缩合步骤为底物特异性的，而其它步骤则不是。实际上，这意味着只要引入对PUFA特异的缩合酶(通常称为“延伸酶”)，原生植物延伸机构就能够延伸PUFA，尽管原生植物延伸机构在延伸非原生PUFA底物中的效率可能较低。在2007年，公布酵母延伸循环脱水酶的鉴别和表征(Denic和Weissman，2007)。植物、苔藓和微藻的PUFA去饱和天然发生于主要在酰基-PC库中的脂肪酸底物，而延伸发生于酰基-CoA库中的底物。通过磷脂酶(PLA)进行来自酰基-PC分子的脂肪酸至CoA载体的转移，同时通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)进行酰基-CoA脂肪酸至PC载体的转移(图18)(Singh等，2005)。工程化地产生LC-PUFA使用需氧Δ6-去饱和/延伸路径进行大部分LC-PUFA代谢工程化。在1996年第一次报道使用来自集胞藻属(Synechocystis)藻青菌的Δ6-去饱和酶在烟草中生物合成γ-亚麻酸(GLA，18：3ω6)(Reddy和Thomas，1996)。最近，已在农作物如红花(在种子油中的73％GLA；Knauf等，2006)和大豆(28％GLA；Sato等，2004)中产生GLA。LC-PUFA如EPA和DHA的产生由于所涉及的增加数目的去饱和和延伸步骤而涉及更复杂的工程化。通过Qi等(2004)第一次报道陆生植物中的EPA产生，他们将编码来自球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)的Δ9-延伸酶、来自眼虫藻(Euglenagracilis)的Δ8-去饱和酶以及来自高山被孢霉(Mortierellaalpina)的Δ5-去饱和酶的基因引入到拟南芥属中，从而产生高达3％EPA。此工作随后由Abbadi等(2004)进行，他们报道在使用编码来自小立碗藓(Physcomitrellapatens)的Δ6-去饱和酶和Δ6-延伸酶以及来自三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)的Δ5-去饱和酶的基因的亚麻仁籽中产生高达0.8％EPA。DHA产生的第一次报道是在WO04/017467中，其中描述3％DHA在大豆胚而不是种子中产生，这通过引入编码异枝水霉(Saprolegniadiclina)Δ6-去饱和酶、高山被孢霉Δ6-去饱和酶、高山被孢霉Δ5-去饱和酶、异枝水霉Δ4-去饱和酶、异枝水霉Δ17-去饱和酶、高山被孢霉Δ6-延伸酶以及路氏巴夫藻(Pavlovalutheri)Δ5-延伸酶的基因来实现。在也产生DHA的胚中的最大EPA水平为19.6％，这指示EPA转化为DHA的效率较差(WO2004/071467)。这个发现与由Robert等(2005)公布的发现类似，其中从EPA至DHA的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.提取的植物脂质，其包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)，其中所述DHA、所述DPA或所述DPA和DHA二者的至少35％以三酰甘油(TAG)的形式在TAG的sn-2位置酯化。/n

【技术特征摘要】
20131218 AU 2013905033;20140627 AU 20149024711.提取的植物脂质，其包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)，其中所述DHA、所述DPA或所述DPA和DHA二者的至少35％以三酰甘油(TAG)的形式在TAG的sn-2位置酯化。


2.权利要求1的脂质，其进一步包含脂肪酸，所述脂肪酸包含油酸、棕榈酸、包括包括亚油酸(LA)的ω6脂肪酸、包括α-亚麻酸(ALA)的ω3脂肪酸以及任选地包含十八碳四烯酸(SDA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十碳四烯酸(ETA)中的一种或多种。


3.权利要求1或2的脂质，其中所述DHA、所述DPA或所述DPA和DHA二者的至少约40％、至少约45％、至少约48％、35％与约60％之间或35％与约50％之间以三酰甘油(TAG)的形式在TAG的sn-2位置酯化。


4.权利要求1-3任一项的脂质，其中所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的DHA的水平、DPA的水平或DPA和DHA的组合水平是约7％、约8％、约9％、约10％、约12％、约15％、约18％、约20％、约22％、约24％、约26％、约28％、约30％、约7％与约28％之间、约7％与约25％之间、约10％与35％之间、约10％与约30％之间、约10％与约25％之间、约10％与约22％之间、约14％与35％之间、约16％与35％之间、约16％与约30％之间、约16％与约25％之间、约16％与约22％之间、约1％与35％之间、约7％与35％之间或约20.1％与35％之间。


5.权利要求1-4任一项的脂质，其具有以下特征中的一个或多个：
i)棕榈酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约2％与15％之间，或约3％与约10％之间；
ii)肉豆蔻酸(C14:0)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约0.1％；
iii)油酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约1％与约30％之间、约3％与约30％之间、约6％与约30％之间、约1％与约20％之间、约30％与约60％之间、约45％至约60％、约30％或者约15％与约30％之间；
iv)亚油酸(LA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4％与约35％之间、约4％与约20％之间、约4％与17％之间或者约5％与约10％之间；
v)α-亚麻酸(ALA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4％与约40％之间、约7％与约40％之间、约10％与约35％之间、约20％与约35％之间、约4％与16％之间或者约2％与16％之间；
vi)γ-亚麻酸(GLA)在所提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、0.05％与7％之间、0.05％与4％之间、0.05％与约3％之间或者0.05％与约2％之间；
vii)十八碳四烯酸(SDA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于约10％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约4％、小于约3％、约0.05％与约7％之间、约0.05％与约6％之间、约0.05％与约4％之间、约0.05％与约3％之间、约0.05％与约10％之间或者0.05％与约2％之间；
viii)二十碳四烯酸(ETA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约1％、小于约0.5％、0.05％与6％之间、0.05％与约5％之间、0.05％与约4％之间、0.05％与约3％之间或者0.05％与约2％之间；
ix)二十碳三烯酸(ETrA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于4％、小于约2％、小于约1％、0.05％与4％之间、0.05％与3％之间或者0.05％与约2％之间或者0.05％与约1％之间；
x)二十碳五烯酸(EPA)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为4％与15％之间、小于4％、小于约3％、小于约2％、0.05％与10％之间、0.05％与5％之间、0.05％与约3％之间或者0.05％与约2％之间；
xi)所述脂质在其脂肪酸含量中包含ω6-二十二碳五烯酸(22:5Δ4,7,10,13,16)；
xii)所述脂质在其脂肪酸含量中包含小于0.1％的ω6-二十二碳五烯酸(22:5Δ4,7,10,13,16)；
xiii)所述脂质在其脂肪酸含量中包含小于0.1％的SDA、EPA和ETA中的一种或多种或所有；
xiv)总饱和脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4％与约25％之间、约4％与约20％之间、约6％与约20％之间或者约6％与约12％之间；
xv)总单一不饱和脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约4％与约40％之间、约4％与约35％之间、约8％与约25％之间、8％与约22％之间、约15％与约40％之间或者约15％与约35％之间；
xvi)总多元不饱和脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约20％与约75％之间、30％与75％之间、约50％与约75％之间、约60％、约65％、约70％、约75％或者约60％与约75％之间；
xvii)总ω6脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为约35％与约50％之间、约20％与约35％之间、约6％与20％之间、小于20％、小于约16％、小于约10％、约1％与约16％之间、约2％与约10％之间或者约4％与约10％之间；
xviii)新ω6脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为小于约10％、小于约8％、小于约6％、小于4％、约1％与约20％之间、约1％与约10％之间、0.5％与约8％之间或者0.5％与4％之间；
xix)总ω3脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为36％与约65％之间、36％与约70％之间、40％与约60％之间、约30％与约60％之间、约35％与约60％之间、40％与约65％之间、约30％与约65％之间、约35％与约65％之间、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％或约70％；
xx)新ω3脂肪酸在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中的水平为21％与约45％之间、21％与约35％之间、约23％与约35％之间、约25％与约35％之间、约27％与约35％之间、约23％、约25％、约27％、约30％、约35％、约40％或约45％；
xxi)在所述提取的脂质的脂肪酸含量中总ω6脂肪酸:总ω3脂肪酸的比率为约1.0与约3.0之间、约0.1与约1之间、约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、约1.0、约0.1、约0.10至约0.4或者约0.2；
xxii)在所述提取的脂质的总脂肪酸含量中新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸的比率为约1.0与约3.0之间、约0.02与约0.1之间、约0.1与约1之间、约0.1与约0.5之间、小于约0.50、小于约0.40、小于约0.30、小于约0.20、小于约0.15、约0.02、约0.05、约0.1、约0.2或约1.0；
xxiii)所述脂质的脂肪酸组成基于通过Δ12-去饱和酶将油酸转化为LA的效率，所述效率为至少约60％、至少约70％、至少约80％、约60％与约98％之间、约70％与约95％之间或者约75％与约90％之间；
xxiv)所述脂质的脂肪酸组成基于通过Δ6-去饱和酶将ALA转化为SDA的效率，所述效率为至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、约30％与约70％之间、约35％与约60％之间或者约50％与约70％之间；
xxv)脂质的脂肪酸组成基于通过Δ6-延伸酶将SDA转化为ETA的效率，所述效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、约60％与约95％之间、约70％与约88％之间或者约75％与约85％之间；
xxvi)所述脂质的脂肪酸组成基于通过Δ5-去饱和酶将ETA转化为EPA的效率，所述效率为至少约60％、至少约70％、至少约75％、约60％与约99％之间、约70％与约99％之间或者约75％与约98％之间；
xxvii)所述脂质的脂肪酸组成基于通过Δ5-延伸酶将EPA转化为DPA的效率，所述效率为至少约80％、至少约85％、至少约90％、约50％与约99％之间、约85％与约99％之间、约50％与约95％之间或者约85％与约95％之间；
xxviii)所述脂质的脂肪酸组成基于通过Δ4-去饱和酶将DPA转化为DHA的效率，所述效率为至少约80％、至少约90％、至少约93％、约50％与约95％之间、约80％与约95％之间或者约85％与约95％之间；
xxix)所述脂质的脂肪酸组成基于将油酸转化为DPA和/或DHA的效率，所述效率为至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、约20％、约25％、约30％、约10％与约50％之间、约10％与约30％之间、约10％与约25％之间或者约20％与约30％之间；
xxx)所述脂质的脂肪酸组成基于将LA转化为DPA和/或DHA的效率，所述效率为至少约15％、至少约20％、至少约22％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约15％与约50％之间、约20％与约40％之间或者约20％与约30％之间；
xxxi)所述脂质的脂肪酸组成基于将ALA转化为DPA和/或DHA的效率，所述效率为至少约17％、至少约22％、至少约24％、至少约30％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约22％与约70％之间、约17％与约55％之间、约22％与约40％之间或者约24％与约40％之间；
xxxii)在所述提取的脂质中的总脂肪酸具有小于1.5％C20:1、小于1％C20:1或约1％C20:1；
xxxiii)所述脂质的三酰甘油(TAG)含量为至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少95％、约70％与约99％之间或者约90％与约99％之间；
xxxiv)所述脂质包含二酰甘油(DAG)，所述DAG优选包含DHA和/或DPA；
xxxv)所述脂质包含小于约10％、小于约5％、小于约1％或者约0.001％与约5％之间游离(非酯化的)脂肪酸和/或磷脂，或者基本上不含游离(非酯化的)脂肪酸和/或磷脂；
xxxvi)在所述脂质中最丰富的含DHA的TAG物质为DHA/18:3/18:3(TAG58:12)；
xxxvii)在所述脂质中最丰富的含DPA的TAG物质为DPA/18:3/18:3(TAG58:11)；以及
xxxviii)所述脂质包含三-DHATAG(TAG66:18)。


6.权利要求1-5任一项的脂质，其中所述脂质是油，优选来自含油种子的油，更优选地，其中所述脂质包含或是芸苔属物种(Brassicasp.)油，如欧洲油菜(Brassicanapus)油或印度芥菜(Brassicajuncea)油，陆地棉(Gossypiumhirsutum)油、亚麻(Linumusitatissimum)油、向日葵属物种(Helianthussp.)油、红花(Carthamustinctorius)油、大豆(Glycinemax)油、玉蜀黍(Zeamays)油、油棕(Elaesisguineenis)油、本氏烟(Nicotianabenthamiana)油、狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)油、亚麻荠(Camelinasativa)油、深海两节荠(Crambeabyssinica)油、奇岗(Miscanthusxgiganteus)油或中国芒(Miscanthussinensis)油。


7.一种产生提取的植物脂质的方法，其包括以下步骤：
i)获得包含脂质的植物部分，所述脂质包含酯化形式的脂肪酸，所述脂肪酸包含二十二碳五烯酸(DPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)，其中所述DHA、所述DPA或所述DPA和DHA二者的至少35％以三酰甘油(TAG)的形式在TAG的sn-2位置酯化；和
ii)从所述植物部分提取脂质，
其中所述DHA、所述DPA或所述DPA和DHA二者的至少35％以三酰甘油(TAG)的形式在TAG的sn-2位置酯化。


8.权利要求7的方法，其中所述提取的脂质具有权利要求2-6任一项中所限定的特征的一或多个。


9.权利要求7或8的方法，其中所述植物部分是种子，优选含油种子，如芸苔属物种，如欧洲油菜或印度芥菜，陆地棉、亚麻、向日葵属物种、红花、大豆、玉蜀黍、油棕、本氏烟、狭叶羽扇豆、亚麻荠、深海两节荠种子，优选欧洲油菜、印度芥菜或亚麻荠种子。


10.权利要求7-9任一项的方法，其中所述植物部分包含编码以下几组酶之一的外源多核苷酸：
i)1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、ω3-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延伸酶和Δ5-延伸酶，
ii)1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延伸酶和Δ5-延伸酶，
iii)1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、Δ12-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶、Δ6-延伸酶和Δ5-延伸酶，
iv)1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶(LPAAT)、Δ12-去饱和酶、ω3-去饱和酶和/或Δ15-去饱和酶、Δ6-去饱和酶、Δ5-去饱和酶、Δ4-去饱和酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·R·皮特里，S·P·辛格，P·什雷斯塔，J·T·麦卡利斯特，M·D·迪瓦恩，R·C·德菲特，
申请(专利权)人：联邦科学技术研究组织，粮食研究发展公司，纽希德私人有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU