一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用。所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统由第一载体和第二载体组成，其中，所述第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin,Alb)切割位点的特异性小向导RNA(sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶(iduronate‑2‑sulfatase,IDS)基因的开放阅读框序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；所述第二载体为携带Cas9的AAV载体。本发明专利技术以CRISPR‑Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒双重载体系统可显著提高MPSII模型小鼠血浆的IDS酶活性以及肝脏组织IDS的表达，经治疗后小鼠表型和骨骼发育均得以改善。本发明专利技术为黏多糖贮积症Ⅱ型的临床治疗提供了一种有效治疗手段。

A dual vector gene therapy system of adeno-associated virus and its application in the treatment of mucopolysaccharidosis type \u2161

【技术实现步骤摘要】
一种腺相关病毒双重载体基因治疗系统及其在治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用
本专利技术涉及一种罕见遗传病黏多糖贮积症Ⅱ型的基因治疗系统，特别涉及一种用于黏多糖贮积症Ⅱ型基因治疗的腺相关病毒双重载体系统，还涉及该系统的构建方法和应用。本专利技术属于医药技术治疗领域。
技术介绍
黏多糖贮积症(mucopolysaccharidosis，MPS)是溶酶体贮积病中非常重要的一类，是由于溶酶体水解酶缺陷，造成酸性黏多糖降解受阻，黏多糖在体内积聚而引起一系列临床症状，发病率约为1/25000。MPS可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型，除了MPSII型外，其余均为常染色体隐性遗传病。黏多糖贮积症Ⅱ型(mucopolysaccharidosistypeII，MPSII)，是一种X连锁隐性遗传的单基因遗传病，其致病基因艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因位于人染色体Xq28，编码550个氨基酸。MPSII患者体内都缺乏艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)，从而导致糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)在溶酶体中的积累。随着组织细胞内GAG沉积的增多，患者将产生一系列功能障碍。MPSII临床表现多样，分为轻型和重型，病情的发展具有进行性加重的特点。重型患者一般2～4岁起病，临床表现为智力落后、侏儒身材、面容丑陋、多发性骨骼畸形、肝脾肿大、心脏病变、少年期死亡等。轻型患者一般10岁前发病，临床症状较轻且寿命一般不受影响。由于MPSII的遗传方式为X连锁隐性遗传，通常只有男性会罹患此病，但在某些极其罕见的病例中，也会出现女性患病的情况。据估计，每10万男性新生儿中有一人罹患MPSII。MPSII患者的治疗主要包括骨髓移植、酶替代治疗和基因治疗。对于有骨骼畸形或精神缺陷的MPSII患者，骨髓移植可能不是最佳选择。重组IDS用于酶替代治疗的安全性和有效性得到了一致的证明。然而，酶替代治疗并不能彻底治愈MPSII，且价格昂贵，患者需终身治疗，普通家庭难以负担得起高昂的费用。基因治疗仍处于探索阶段。目前，腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是基因治疗领域的热门病毒，它是微小病毒科的成员之一，为无包膜的单链线状DNA病毒。通常情况下，AAV需要腺病毒、疱疹病毒等辅助病毒的帮助，才能进行自我复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV可在哺乳动物中长期潜伏。AAV病毒载体可感染分裂和非分裂细胞，毒性和免疫原性低，适合以相对较高的转染效率在非分裂细胞中长期表达和在分裂细胞中短期表达基因。重组AAV不整合到染色体，可长期表达外源基因，单纯注射含有目的基因开放阅读框的AAV治疗方案并非是一劳永逸的。重组AAV载体的外源基因容量有限，两个末端重复序列(ITR)之间的空间只有4.7kb，因此可插入的外源基因约为3.5kb，甚至更小，故而本专利技术设计了双重AAV病毒载体系统。需要注意的是，体内存在的中和抗体可阻断AAV感染，严重影响治疗效果。AAV的各血清型在人群和各种实验动物中均存在较高的流行率，人群中AAV2的流行率可达30％～60％，AAV7/8/9的流行率可达15％～30％；而实验动物猴群中的AAV7/8/9的流行率甚至接近100％。为了避免中和抗体阻断AAV感染，优选的，本专利技术选用的AAV血清型为人工合成的AAV-DJ(StructureofAAV-DJ,aRetargetedGeneTherapyVector:Cryo-ElectronMicroscopyatresolution,ThomasF.Lerch.et.al,Structure.2012Aug8；20(8):1310–1320.),以CRISPR-Cas9为基因编辑工具设计腺相关病毒(AAV)双重载体系统对MPSII进行基因治疗。CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和小向导RNA(smallguideRNA，sgRNA)两个元件组成，而crRNA和tracrRNA又组成了sgRNA。研究已经证明，Cas9是由sgRNA引导的能对目的基因进行切割的核酸内切酶，通过与crRNA和tracrRNA形成复合物起作用。Cas9由核酸酶(NUC)叶以及α-螺旋识别(REC)叶组成，NUC叶包含三个结构域：HNH核酸酶结构域，切割DNA的正义链(与小向导RNA互补)；RuvC样核酸酶结构域，切割DNA的反义链；PAM(protospacerassociatedmotif)相互作用结构域(PI结构域)，通过与DNA的PAM区域的碱基特异性相互作用，有助于Cas9的DNA靶特异性(JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,etal.Aprogrammabledual-RNA–guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science,2012,337(6096):816-821.)。针对罕见遗传病MPSII，2017年，Sangamo公司宣布，FDA授予公司临床阶段体内基因组编辑候选产品SB-913快速通道地位，用于治疗MPSII。11月，Sangamo公司宣布，其在研疗法SB-913完成了首例患者给药。SB-913以锌指核酸酶(ZFN)为基因编辑工具，将目的基因插入到肝细胞中白蛋白基因的特定位点，从而实现治疗的目的。与ZFN相比，本专利技术中使用的基因编辑工具CRISPR-Cas9系统具有简便、经济、耗时短等优点。针对罕见遗传病的基因治疗，有的放矢，将会成为一种重要的治疗方案。
技术实现思路
针对目前黏多糖贮积症Ⅱ型的治疗效果欠佳的问题，本专利技术的目的在于提供一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(AAV)双重载体基因治疗系统，以及该载体系统在用于治疗黏多糖贮积症Ⅱ型中的应用，本专利技术的腺相关病毒(AAV)双重载体基因治疗系统能够从根本上提高艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的活性，从而有效改善MPSII遗传病的临床症状。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：为了证明以CRISPR-Cas9为基因编辑工具设计的腺相关病毒(AAV)双重载体系统对于MPSII的治疗作用，本专利技术建立了MPSII小鼠模型，以该腺相关病毒(AAV)双重载体系统对MPSII小鼠进行基因治疗。该治疗系统由第一载体和第二载体组成，其中一种载体设计为携带靶向小鼠白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(smallguideRNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，该AAV载体靶向于黏多糖贮积症Ⅱ疾病小鼠的肝细胞，sgRNA特异性识别小鼠肝细胞中白蛋白基因(Alb)的特定切割位点(切割位点位于白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间)；另一种载体为携带Cas9的AAV载体，用于在sgRNA特异性识别的切割位点进行特异性的切割，然后将人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)双重载体基因治疗系统，其特征在于，由第一载体和第二载体组成，其中，所述的第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(small guideRNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于人源白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；/n所述的第二载体为携带Cas9的AAV载体，用于在所述sgRNA靶向识别的切割位点进行特异性的切割。/n

【技术特征摘要】
1.一种以CRISPR-Cas9为基因编辑工具的腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)双重载体基因治疗系统，其特征在于，由第一载体和第二载体组成，其中，所述的第一载体为携带有靶向人源白蛋白基因(Albumin，Alb)切割位点的特异性小向导RNA(smallguideRNA，sgRNA)以及人源艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)基因的开放阅读框(ORF)序列的AAV载体，其中，所述的切割位点位于人源白蛋白基因翻译起始密码子atg的第2、3位碱基之间；
所述的第二载体为携带Cas9的AAV载体，用于在所述sgRNA靶向识别的切割位点进行特异性的切割。


2.如权利要求1所述的腺相关病毒双重载体基因治疗系统，其特征在于，所述的靶向人源白...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙文靖，吴杰，贾学渊，于函菲，白静，傅松滨，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23