高纯度甜菊醇糖苷制造技术

描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷，特别是莱鲍迪苷M、D、E和I的方法。该方法包括利用酶制剂和重组微生物将各种起始组合物转化为目标甜菊醇糖苷。高度纯化的莱鲍迪苷可以在可食用和可咀嚼的组合物(诸如任何饮料、糖果、烘焙产品、饼干和口香糖)中用作无热量的甜味剂。

High purity steviol glycoside

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高纯度甜菊醇糖苷
本专利技术涉及制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高纯度的甜菊醇糖苷组合物)的方法。序列表与本文同时提交的、2017年5月15日创建的标题为“PC_71PROV_Seq_Listing_ST25.txt”的15kb数据大小的文本文件在此通过引用整体并入本申请。专利技术背景高强度甜味剂的甜度水平是蔗糖的甜度水平的许多倍。它们基本上是无热量的，普遍用于饮食和热量减少的产品(包括食品和饮料)中。高强度甜味剂不会引起血糖反应，因此使得其适合用于针对糖尿病患者和意在控制其对碳水化合物的摄入的其他人的产品中。甜菊醇糖苷是在甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)(原产于南美洲某些地区的菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))的多年生灌木)的叶子中发现的一类化合物。它们的结构特点是单碱基甜菊醇，不同之处在于位置C13和C19处碳水化合物残基的存在。它们在甜叶菊叶中积累，约占总干重的10％-20％。以干重计，甜叶菊叶中发现的四种主要糖苷通常包括甜菊糖苷(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0％)和杜尔可苷A(0.3％)。其他已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M、甜菊醇双糖苷和甜茶苷。尽管已知从甜叶菊中制备甜菊醇糖苷的方法，但是这些方法中的许多不适合商业使用。因此，仍然需要简单、高效和经济的方法来制备包含甜菊醇糖苷的组合物，包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。专利技术概述本专利技术提供了通过使包含有机底物的起始组合物与微生物细胞和/或酶制剂接触，从而产生包含目标甜菊醇糖苷的组合物来制备包含目标甜菊醇糖苷的组合物的方法。起始组合物可以是包含至少一个碳原子的任何有机化合物。在一个实施方案中，起始组合物选自甜菊醇糖苷、多元醇或糖醇、各种碳水化合物。目标甜菊醇糖苷可以是任何甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是甜菊醇单糖苷、甜菊醇双糖苷、甜茶苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊糖苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。在另一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷E。在另一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。在另一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷I。在另一个实施方案中，目标甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷M。在一些优选实施方案中，使用了能够将起始组合物转化成目标甜菊醇糖苷的包含一种或多种酶的酶制剂或包含一种或多种酶的微生物细胞。酶可以位于细胞的表面和/或内部。酶制剂可以以全细胞悬液、粗裂解物或纯化酶的形式提供。酶制剂可呈游离形式或固定在由无机或有机材料制成的固体载体上。在一些实施方案中，微生物细胞包含必需的酶和编码其的基因，用于将起始组合物转化为目标甜菊醇糖苷。因此，本专利技术还提供了制备包含目标甜菊醇糖苷的组合物的方法，所述方法包括使包含有机底物的起始组合物与包含至少一种能够将所述起始组合物转化为目标甜菊醇糖苷的酶的微生物细胞接触，由此产生包含至少一种目标甜菊醇糖苷的培养基。将起始组合物转化为目标甜菊醇糖苷所必需的酶包括甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶(UGT)和/或UDP-再循环酶。在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)途径酶。在另一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶。在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶选自下述：牻牛儿牻牛儿基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰基-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸盐脱羧酶、细胞色素P450还原酶等。UDP-葡糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷底物以提供目标甜菊醇糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个实施方案中，在微生物细胞中产生甜菊醇生物合成酶和UDP-葡糖基转移酶。微生物细胞可以是例如大肠杆菌(E.coli)、酵母属的种(Saccharomycessp)、曲霉属的种(Aspergillussp.)、毕赤酵母属的种(Pichiasp.)、芽孢杆菌属的种(Bacillussp.)、耶氏酵母属的种(Yarrowiasp.)等。在另一个实施方案中，合成UDP-葡糖基转移酶。在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶选自UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、UGT91D2和与这些多肽具有显著(＞85％、＞86％、＞87％、＞88％、＞89％、＞90％、＞91％、＞92％、＞93％、＞94％、＞95％、＞96％、＞97％、＞98％、＞99％)的氨基酸序列同一性的UGT以及编码这些UGT的分离的核酸分子。在一个实施方案中，一种微生物(微生物细胞)中存在甜菊醇生物合成酶、UGT和UDP-葡萄糖再循环系统。微生物可以是例如大肠杆菌、酵母属的种、曲霉属的种、毕赤酵母属的种、芽孢杆菌属的种、耶氏酵母属的种。在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜茶苷以形成甜菊糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个特定的实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2或与UGT91D2具有＞85％的氨基酸序列同一性的UGT。在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊糖苷以形成莱鲍迪苷A的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个特定的实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1或与UGT76G1(SEQID3)具有>85％的氨基酸序列同一性的UGT。在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A以形成莱鲍迪苷D的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个特定的实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2或与UGT91D2具有>85％的氨基酸序列同一性的UGT。在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是UGTSL2或与UGTSL2(SEQID2)具有＞85％氨基酸序列同一性的UGT。在又一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷M的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产高度纯化的目标甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：/na.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；/nb.提供酶制剂或微生物，其包含选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶和任选地UDP-葡萄糖再循环酶的至少一种酶；/nc.使所述酶制剂或微生物与含有所述起始组合物的培养基接触以产生包含至少一种目标甜菊醇糖苷的培养基。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170515 US 62/506,357;20171106 US 62/581,8801.一种生产高度纯化的目标甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；
b.提供酶制剂或微生物，其包含选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶和任选地UDP-葡萄糖再循环酶的至少一种酶；
c.使所述酶制剂或微生物与含有所述起始组合物的培养基接触以产生包含至少一种目标甜菊醇糖苷的培养基。


2.一种用于生产高度纯化的目标甜菊醇糖苷的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含具有至少一个碳原子的有机化合物的起始组合物；
b.提供生物催化剂，其包含选自甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶和任选地UDP-葡萄糖循环酶的至少一种酶；
c.使所述生物催化剂与包含所述起始组合物的培养基接触以产生包含至少一种目标甜菊醇糖苷的培养基。


3.权利要求1或2的方法，其还包括以下步骤：
d.从所述培养基中分离所述目标甜菊醇糖苷以提供高度纯化的目标甜菊醇糖苷组合物。


4.权利要求1或2所述的方法，其中所述起始组合物选自甜菊醇、甜菊醇糖苷、多元醇、碳水化合物及其组合。


5.权利要求1的方法，其中所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、酵母属的种(Saccharomycessp.)、曲霉属的种(Aspergillussp.)、毕赤酵母属的种(Pichiasp.)、芽孢杆菌属的种(Bacillussp.)和耶氏酵母属的种(Yarrowiasp.)。


6.权利要求2的方法，其中所述生物催化剂是酶或包含一种或多种酶的细胞，其能够将所述起始组合物转化为目标甜菊醇糖苷。


7.权利要求1或2的方法，其中所述目标甜菊醇糖苷选自rebM、rebD、rebI和/或rebE及其混合物。


8.权利要求1或2的方法，其中所述酶选自甲羟戊酸(MVA)途径酶、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶、牻牛儿牻牛儿基二磷酸合酶、柯巴基二磷酸合酶、贝壳杉烯合酶、贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞嘧啶基-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰基-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、细胞色素P450还原酶、UGT74G1、UGT85C2、UGT91D2、EUGT11、UGTSL2、UGT76G1或其具有>85％的氨基酸序列同一性、＞86％的氨基酸序列同一性、＞87％的氨基酸序列同一性、＞88％的氨基酸序列同一性、＞89％的氨基酸序列同一性、＞90％的氨基酸序列同一性、＞91％的氨基酸序列同一性、＞92％的氨基酸序列同一性、＞93％的氨基酸序列同一性、＞94％的氨基酸序列同一性、＞95％的氨基酸序列同一性、＞96％的氨基酸序列同一性、＞97％的氨基酸序列同一性、＞98％的氨基酸序列同一性、＞99％的氨基酸序列同一性的其突变型变体。


9.权利要求3的方法，其中以干重计，所述目标甜菊醇糖苷含量大于约95重量％。


10.一种消费品，其包含通过权利要求3的方法产生的高度纯化的目标糖苷组合物，其中所述产品选自食物、饮料、药物组合物、烟草产品、营养品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。


11.一种消费品，其包含通过权利要求3的方法产生的高度纯化的目标甜菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自食物、饮料、药物组合物、烟草产品、营养品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中所述目标甜菊醇糖苷是rebD。


12.一种消费品，其包括通过权利要求3的方法产生的高度纯化的目标甜菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自食物、饮料、药物组合物、烟草产品、营养品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中所述目标甜菊醇糖苷是rebM。


13.一种消费品，其包含通过权利要求3的方法产生的高度纯化的目标甜菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自食物、饮料、药物组合物、烟草产品、营养品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中所述目标甜菊醇糖苷是rebE。


14.一种消费品，其包含通过权利要求3的方法产生的高度纯化的目标甜菊醇糖苷组合物，其中所述产品选自食物、饮料、药物组合物、烟草产品、营养品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中所述目标甜菊醇糖苷是rebI。


15.权利要求10的消费品，其中所述组合物选自饮料；天然果汁；提神饮料；碳酸软饮料；减肥饮料；零热量饮料；热量减少的饮料和食物；酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·马科斯雅恩，S·普尔卡亚萨，C·拜尔，A·沃格，S·克普克，S·巴特施，B·布鲁彻，C·菲勒，S·肖纳特，M·萨洛莫，T·舒尔钦，
申请(专利权)人：谱赛科美国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US