表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺、肠道病毒71型疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺、肠道病毒71型疫苗及其制备方法。所述诱导工艺包括有在诱导阶段流加甲醇步骤，所述流加甲醇步骤包括：在第一阶段，添加甲醇的浓度为0‑0.90g/L；在第二阶段，添加甲醇的浓度为0.90‑3.0g/L。实施本发明专利技术，可在诱导阶段促进酵母生长，使发酵罐的细胞密度损失较小，提高诱导效率，减少死细胞比例，并显著提高抗原表达量。

Fermentation induction of recombinant enterovirus 71 like particles, enterovirus 71 vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺、肠道病毒71型疫苗及其制备方法
本专利技术涉及重组肠道病毒71型病毒疫苗制备
，尤其涉及一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺、肠道病毒71型疫苗及其制备方法。
技术介绍
甲醇在重组肠道病毒71型(EV71)病毒样颗粒疫苗的发酵过程中作为诱导剂和碳源，对提高抗原的产率有着重要影响。现有技术中，采用的诱导方案主要有两种：一种是恒流速流加甲醇，另一种是恒浓度流加甲醇，都存在较大的缺陷。恒流速流加甲醇方式所采用最佳流速会导致发酵后期的甲醇浓度过高，对细胞具有毒性，细胞损失量大，活性降低很多，影响抗原表达；恒浓度流加甲醇所采用最佳浓度会导致发酵前期的甲醇浓度过高，对细胞具有毒性，细胞损失量大，活性降低很多，同样影响抗原表达。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺，该工艺可在诱导阶段促进汉逊酵母生长，使发酵罐的细胞密度损失较小，提高诱导效率，减少死细胞比例，并显著提高抗原表达量。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组肠道病毒71型疫苗抗原的制备方法，该方法可在诱导阶段促进汉逊酵母生长，使发酵罐的细胞密度损失较小，提高诱导效率，减少死细胞比例，并显著提高抗原表达量。本专利技术进一步所要解决的技术问题是，提供一种重组肠道病毒71型疫苗，该疫苗由具有显著提高的重组肠道病毒71型抗原表达量的重组汉逊酵母发酵液经破碎、纯化等工艺制备。r>为解决上述技术问题，本专利技术公开了以下技术方案：一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺，包括有在诱导阶段流加甲醇步骤，所述流加甲醇步骤包括：在第一阶段，添加甲醇的浓度为0-0.90g/L；和/或者在第二阶段，添加甲醇的浓度为0.90-3.0g/L。在一些可能的实施方式中，所述第一阶段具体包括第三阶段和第四阶段，在第三阶段，添加甲醇的浓度为0-0.40g/L、和/或者，在第四阶段，添加甲醇的浓度为0.40-0.90g/L。在一些可能的实施方式中，所述第二阶段具体包括第五阶段和第六阶段，在第五阶段，添加甲醇的浓度为0.90-1.30g/L、和/或者，在第六阶段，添加甲醇的浓度为1.30-3.00g/L。在一些可能的实施方式中，所述第一阶段为诱导开始至20小时；和/或者，所述第二阶段为诱导开始20小时至发酵结束。在一些可能的实施方式中，所述第三阶段为诱导开始10小时内。在一些可能的实施方式中，所述第四阶段为诱导开始10小时至20小时。在一些可能的实施方式中，所述第五阶段为诱导开始20小时至30小时。在一些可能的实施方式中，所述第六阶段为诱导开始30小时至发酵结束。相应地，本专利技术还公开了一种重组肠道病毒71型疫苗的制备方法，采用如上所述的发酵诱导工艺。相应地，本专利技术还公开了一种重组肠道病毒71型疫苗，采用如上所述的制备方法制备得到。本专利技术的有益效果是：本专利技术的实施例通过在细胞诱导培养阶段，分多个阶段从低到高控制发酵罐中不同浓度的甲醇含量，不仅能够在前期使细胞较好的适应甲醇环境，并且能够较好的诱导细胞表达目的蛋白，在诱导阶段促进汉逊酵母生长，使发酵罐的细胞密度损失较小，提高了诱导效率，减少了死细胞比例。使疫苗的表达量提高了约130％。在疫苗的研发及实际生产中，极大地节约了成本，具有良好的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺的OD、湿重和甲醇浓度示意图。图2是本专利技术实施例提供的表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺的湿重和甲醇浓度与现有技术的对比示意图。具体实施方式下面参考附图详细描述本专利技术提供的表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺的实施例；本实施例包括有在诱导阶段流加甲醇步骤，所述流加甲醇步骤包括：在第一阶段，添加甲醇的浓度为0-0.90g/L；和/或者在第二阶段，添加甲醇的浓度为0.90-3.0g/L。在一些可能的实施方式中，所述第一阶段具体包括第三阶段和第四阶段，在第三阶段，添加甲醇的浓度为0-0.40g/L、和/或者，在第四阶段，添加甲醇的浓度为0.40-0.90g/L。在一些可能的实施方式中，所述第二阶段具体包括第五阶段和第六阶段，在第五阶段，添加甲醇的浓度为0.90-1.30g/L、和/或者，在第六阶段，添加甲醇的浓度为1.30-3.00g/L。在一些可能的实施方式中，所述第一阶段为诱导开始至20小时；和/或者，所述第二阶段为诱导开始20小时至发酵结束。进一步地：在一些可能的实施方式中，所述第三阶段为诱导开始10小时内。在一些可能的实施方式中，所述第四阶段为诱导开始10小时至20小时。在一些可能的实施方式中，所述第五阶段为诱导开始20小时至30小时。在一些可能的实施方式中，所述第六阶段为诱导开始30小时至发酵结束。本专利技术实施例提供的一种重组肠道病毒71型疫苗的制备方法，采用如上所述的发酵诱导工艺，其余与现有技术相同，不再一一赘述。本专利技术实施例提供的一种重组肠道病毒71型疫苗，采用如上所述的制备方法制备得到，不再一一赘述。为了更进一步阐释本实施例为达成预定专利技术目的所采取的的技术手段和效果，对本实施例表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺的具体步骤，通过实例数据详细说明如下。实施例1：分阶段浓度梯度流加甲醇。将AU-PMV-P1-3CD重组表达菌株(14代工作菌种)通过1L锥形瓶培养(30-35℃、20-24小时)、5L锥形瓶培养(30-35℃、20-24小时)、30L发酵罐发酵培养(30-35℃、20-24小时)，得到30L发酵罐种子培养液。将30L发酵罐种子培养液接种到200L发酵罐中，通过生长阶段培养和去阻遏阶段培养后，然后进入诱导阶段。生长阶段培养：发酵至约24小时左右，溶氧第一次开始回升至100％，发酵液中甘油耗尽，开始补加第一次甘油42g/L发酵液，当发酵至约28.5小时时，发酵液中甘油耗尽，溶氧第二次回升至100％，补加第二次甘油42g/L发酵液、少量元素溶液2.5g/L发酵液和基础培养基25g/L发酵液，当发酵至约31.5小时时，发酵液中甘油耗尽，溶氧第三次开始回升至100％，补加第三次甘油42g/L发酵液，当发酵至约33.5小时时，发酵液中甘油耗尽，溶氧第四次开始回升至100％，补加第四次甘油42g/L发酵液，当发酵至约35.5小时时，发酵液中甘油耗尽，溶氧第五次开始回升至100％，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺，包括有在诱导阶段流加甲醇步骤，其特征在于，所述流加甲醇步骤包括：/n在第一阶段，添加甲醇的浓度为0-0.90g/L；和/或者/n在第二阶段，添加甲醇的浓度为0.90-3.0g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达重组肠道病毒71型病毒样颗粒的发酵诱导工艺，包括有在诱导阶段流加甲醇步骤，其特征在于，所述流加甲醇步骤包括：
在第一阶段，添加甲醇的浓度为0-0.90g/L；和/或者
在第二阶段，添加甲醇的浓度为0.90-3.0g/L。


2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述第一阶段具体包括第三阶段和/或第四阶段，在第三阶段，添加甲醇的浓度为0-0.40g/L、和/或者，在第四阶段，添加甲醇的浓度为0.40-0.90g/L。


3.如权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述第二阶段具体包括第五阶段和/或第六阶段，在第五阶段，添加甲醇的浓度为0.90-1.30g/L、和/或者，在第六阶段，添加甲醇的浓度为1.30-3.00g/L。


4.如权利要求1-3中任一项所述的工...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟礼军，彭逸云，陈可勇，覃琴，李进，李海欧，李国顺，
申请(专利权)人：深圳康泰生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44