用于产生双功能蛋白质及其衍生物的方法技术

本发明专利技术提供了用于产生包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的双功能蛋白质的方法。所述方法通过有效地阻止靶蛋白的分解允许稳定地产生靶蛋白，并因此具有高的商业应用潜能。

Methods for producing bifunctional proteins and their derivatives

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生双功能蛋白质及其衍生物的方法
本专利技术涉及用于产生包含生物活性蛋白和成纤维细胞生长因子21(FibroblastGrowthFactor21，FGF21)突变蛋白的双功能蛋白质的方法。
技术介绍
当使用动物细胞以产生重组蛋白时，可能存在靶蛋白的特定区域可被动物细胞(宿主细胞)分泌的蛋白酶剪切而导致重组蛋白的异质性、降低或失活的问题。另外，所表达蛋白的这样的剪切还导致在产生和纯化过程期间难以维持“批次之间(lottolot)”同质性的问题。由于这个原因，在重组蛋白的产生期间将蛋白酶保持在低水平或抑制蛋白酶活性是必需的。作为解决该问题的替代方案，提出了在培养基中添加针对丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸或氨基肽酶的抑制剂(例如抑蛋白酶多肽(aprotinin)、苯丁抑制素(bestatin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、E-64和胃蛋白酶抑制剂A(pepstatinA)等)的产生方法(参见WO1990-002175、EP0,306,968和US5,851,800)。然而，由于细胞毒性以及需要额外的努力来证明它们已从最终产品中完全去除，在商业生产中这些抑制剂的使用并不有效。另外，在常规替代方案中，尚未发现适用于宿主细胞中产生的所有靶蛋白的通用方法。
技术实现思路
技术问题本专利技术的一个目的是提供用于产生包含生物活性蛋白和FGF21突变蛋白的双功能蛋白质的培养方法，其具有改善的药动学参数、高稳定性、较少的聚集形成复合物的潜能、以及较少的免疫原性潜能。问题的解决方案>根据本专利技术的一个目的，提供了用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQIDNO：53)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQIDNO：54)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQIDNO：55)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种；以及(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。专利技术的有益效果本专利技术的产生方法通过有效地阻止靶蛋白的分解允许稳定地产生靶蛋白。附图简述图1是示出在对表达双功能蛋白质的细胞系进行悬浮培养之后，通过SDS-PAGE分析培养物上清液的结果的示意图。发现随着培养时间的流逝，其他小于非经剪切双功能蛋白质的蛋白质一起表达。图2是示出在一定时间段之后根据储存温度条件通过SDS-PAGE分析培养物上清液的结果的示意图。与储存在37℃下的培养物上清液相比，储存在4℃或-20℃下的培养物上清液显示出双功能蛋白质的剪切降低。该结果表明，双功能蛋白质的剪切现象是由来源于宿主细胞的蛋白酶诱导的。图3是示出向培养物上清液添加蛋白酶抑制剂并将混合物在37℃下储存一定时间段之后通过SDS-PAGE分析的结果的示意图。发现主要添加丝氨酸蛋白酶抑制剂降低了双功能蛋白质的剪切现象。该结果表明，双功能蛋白质的剪切现象是由来源于宿主细胞的蛋白酶诱导的。图4是在其中向培养基添加硫酸葡聚糖的细胞培养之后，通过SDS-PAGE分析培养物上清液的结果及其图。当添加重均分子量为1.6kDa的硫酸葡聚糖时，未观察到降低双功能蛋白质的剪切现象的作用，而当添加500kDa的硫酸葡聚糖时，双功能蛋白质的剪切现象降低。图5是示出在与添加至培养基的具有不同重均分子量的硫酸葡聚糖一起培养之后，通过SDS-PAGE分析培养物上清液的结果的示意图。当将重均分子量为200kDa或更多的硫酸葡聚糖添加至培养基时，双功能蛋白质的剪切现象降低。图6是在其中向培养基添加多种浓度下的硫酸葡聚糖的培养之后的培养物上清液的SDS-PAGE分析的结果及其图。当以200至1,000mg/L添加硫酸葡聚糖时，双功能蛋白质的剪切现象降低。另外，当在培养期间将培养温度改变至32℃时，可更有效地阻止双功能蛋白质的剪切现象。实施本专利技术的最佳方式根据本专利技术的一个目的，提供了用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQIDNO：53)(下文称为“EIRP”)；(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQIDNO：54)(下文称为“TGLEAV”)；(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQIDNO：55)(下文称为“TGLEAN”)；(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N(下文称为“G170N”)；(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N(下文称为“G174N”)；(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种(下文称为“A180E”)；以及(7)用于降低野生型FGF21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。FGF21突变蛋白野生型FGF21蛋白(已知在葡萄糖和脂质稳态中发挥重要作用的激素)可以是来源于哺乳动物(例如人、小鼠、猪、猴等)、优选来自人的FGF21蛋白。更优选地，野生型FGF21蛋白可以是具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的野生型人FGF21蛋白。优选地，FGF21突变蛋白中包含的突变可以是：EIRP、TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种；TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种与EIRP突变的组合；EIRP、TGLEAV、TGLEAN、G170N和G174N突变中的任一种与A180E突变的组合；或TGLE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养所述哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：/n(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQ IDNO：53)；/n(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQID NO：54)；/n(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQID NO：55)；/n(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；/n(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；/n(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种；以及/n(7)用于降低野生型FGF21货白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170421 KR 10-2017-00517581.用于从用含有编码双功能蛋白质或其衍生物的cDNA的表达载体转化的哺乳动物宿主细胞产生重组双功能蛋白质的方法，所述方法包括在补充有硫酸葡聚糖的培养基中培养所述哺乳动物宿主细胞，其中所述双功能蛋白质包含：成纤维细胞生长因子21(FGF21)突变蛋白；生物活性蛋白或其突变体或片段；以及免疫球蛋白Fc区，其中所述FGF21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)中的至少一种突变：
(1)从野生型FGF21蛋白的N端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列EIRP(SEQIDNO：53)；
(2)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAV(SEQIDNO：54)；
(3)从野生型FGF21蛋白的N端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列TGLEAN(SEQIDNO：55)；
(4)从野生型FGF21蛋白的N端起第170位的氨基酸替换为氨基酸N；
(5)从野生型FGF21蛋白的N端起第174位的氨基酸替换为氨基酸N；
(6)从野生型FGF21蛋白的N端起第180位的氨基酸替换为氨基酸E，连同上述突变(1)至(5)中的一种或更多种；以及
(7)用于降低野生型FGF21货白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物活性蛋白是选自以下的生物活性货白：胰岛素、...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔秉贤，林仁焕，朴俊映，李镇炯，金基鸿，曹海溶，金埈焕，宋武泳，金锺均，
申请(专利权)人：株式会社柳韩洋行，
类型：发明
国别省市：韩国;KR