一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途技术

本发明专利技术属于动物细胞基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法及其应用，本发明专利技术将采用CRISPR技术敲除小鼠HER2基因，同时利用慢病毒感染将人源化HER2基因插入到小鼠乳腺癌细胞4T1中。本发明专利技术构建的HER2人源化小鼠乳腺癌人源化肿瘤模型不仅可用于抗体肿瘤药效的评估，对药物开发的临床效果有着重要的指导意义。同时也是抗人HER2抗体药物安全性评价的理想模型，对HER2抗体药物&HER 2‑CAR T、HER 2‑CAR NK免疫细胞疗法的毒理学进行临床前体内评价，填补了市场空白。

A kind of HER2 gene humanized mouse tumor cell model, construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型、构建方法以及用途
本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰
，涉及基于CRISPR/Cas9技术的muHER2基因人源化动物肿瘤细胞模型的构建方法及其在生物医药的应用。
技术介绍
HER2又称之为CerbB-2，中文名为人表皮生长因子受体-2。大约有15-20%的乳腺癌患者为Her-2阳性，即Her-2基因异常扩增，它是这种类型乳腺癌的发病原因之一。有研究证明Her-2阳性，表示该患者的癌细胞恶性程度较高，生存期较其他类型短。乳腺癌目前是中国女性发病率第1位的恶性肿瘤，严重威胁着患者的健康。HER2阳性乳腺癌约占侵袭性乳腺癌的20%～30%，与肿瘤的高侵袭性、高复发风险、进展快速及不良预后相关。大量针对HER2靶点抗体药物、CART、CARNK等的研发及临床应用，改变了这部分患者的预后。HER2基因是原癌基因，位于人类第17号染色体长臂（17q21-q22），又称ErbB2，属于ERB家族中的一员，其他成员还包括ErbB1（EGFR）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4），这个家族在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。而HER2受体由胞外配体结合域（ECD）、亲脂的跨膜域（TMD）和带有调节羧基末端片段的胞内域（ICD）构成。HER2至今仍未发现高亲和力配体，必须与家族其他成员组成同源或异源二聚体，受体二聚化后构象发生改变，并与ATP结合激活胞内的酪氨酸激酶活性，为多种下游分子提供停泊位点，从而启动下游信号传导通路，继而传导入细胞核，激活核内一系列转录因子，在转录水平调控、合成供细胞生长、增殖、分化所需蛋白质，但许多肿瘤的发生、发展和病情轻重也与HER2活性大小密切相关，近几年大量针对HER2靶点抗体药物、CART、CARNK等的研发及临床应用，使肿瘤患者看到了希望。但复杂的生物过程通常需要进行体内分析，而人体内生物学的研究受到道德和技术的严重限制，因此越来越需要小鼠肿瘤细胞模型来进行人体细胞、组织和器官的体内研究。目前，科学家们已经开发了多种人源化小鼠肿瘤细胞来克服这些限制，并且现在已经成为人体细胞和组织体内研究的重要工具。在临床药物的研发过程中，小鼠被广泛用于候选药物临床前的安全性及有效性评价，如新型抗病毒药物的体内有效性评价、肿瘤的免疫治疗和开发新型的化学治疗药物、新型抗自身免疫病药物的治疗效果、药物体内代谢和肝毒性、人源抗体的前期开发评估等。因此，在不改变小鼠免疫系统的前提下，构建人源化小鼠肿瘤细胞模型具有重要的意义，可以更好的反应预期临床数据。HER2免疫检查点抑制剂突破了黑色素瘤的瓶颈，Ipilimumab(Yervoy)是靶向作用于HER2的全人源化单克隆抗体，于2011年被FDA批准治疗转移性黑色素瘤。临床前及临床试验结果表明，使用HER2抑制剂+PD1抑制剂的联合治疗时，黑色素瘤疗效高达75％(HER2抑制剂是30％，PD1是45％)。Ipilimumab在肺癌治疗中的临床试验中，与化疗药物紫杉醇/卡铂联合使用，用于NSCLC试验，毒副反应可很好的耐受。同时，目前有多个Ipilimumab联合其他免疫检查点或小分子化药等的临床正在推进，如Ipilimumab与PD-1抑制剂Opdivo(nivolumab)已合并用于黑色素瘤治疗。Ipilimumab作为肿瘤免疫治疗先驱，开启了免疫治疗的先河。但同时，伴随着严重的临床毒副作用导致了临床试验的紧急叫停，Ipilimumab治疗的患者一半以上产生了3-4级严重的副作用，导致皮肤、垂体和肠道毒性反应，限制了抗人HER2抗体的研发与应用。尤其在免疫联合治疗的潮流下，Ipilimumab与其他靶点药物(如PD-1抗体Nivolumab)强强联合是未来的趋势，如何提高抗HER2抗体在肿瘤免疫治疗中的效果，并减少其诱发的免疫副作用，成一个亟待解决的课题。利用基因改造技术，将小鼠肿瘤细胞模型muHER2基因的胞外区进行人源化，保留胞内区及跨膜区序列，构建人源化小鼠肿瘤细胞，具有可直接进行人hsHER2抑制剂的评价、小鼠自身免疫系统不受影响、因小鼠近交系特点实验数据高重复性的特点。利用HER2人源化的小鼠肿瘤细胞模型，可以有效的评价抗人HER2抗体及CART调动免疫系统对人源化肿瘤细胞的杀伤；模拟临床上Ipilimumab单用及联用造成的各个脏器的免疫副作用，可以用于评估抗人HER2抗体及CART的安全性。因此，HER2人源化小鼠肿瘤细胞模型（4T1-huHER2）可以有效地推动抗体药物从体外筛选到临床试验的进程，并为药物临床前试验提供充足有力的数据(抗肿瘤药效分析及验证、免疫治疗与小分子药物、免疫治疗抗体药物与化疗联合用药的药效评价等)。综上所述，建立一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法非常必要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞模型的构建方法；可用于建立抗人HER2抗体临床前筛选的HER2人源化小鼠肿瘤细胞模型及药效评价平台。本专利技术的目的还在于提供一种HER2基因修饰人源化小鼠肿瘤细胞模型的应用。本专利技术的第一个方面，提供了：一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，包括如下步骤：第1步，确定HER2人源序列以及所述HER2人源序列在小鼠细胞模型HER2基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型HER2基因的胞外区替换为所述HER2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgRNA；第3步，设计并构建携带所述HER2人源序列的人源化载体；第4步，将Cas9-sgRNA载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型HER2基因敲除，获得HER2基因敲除的细胞；第5步，构建含有人源化HER2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的HER2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源HER2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源HER2基因的胞外区序列。在一个实施方式中，HER2人源序列如SEQIDNO.8所示。在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgRNA的序列如SEQIDNO.2或者SEQIDNO.3所示。在一个实施方式中，第3步中人源化打靶载体的构建方法包括：使用BsmbI酶切LentiCRISPRV2质粒，再将产物与sgRNA连接，转化至感受态细胞中。在一个实施方式中，含有人源HER2基因的载体的构建方法是：将含有HER2人源胞外区、HER2鼠源跨膜区和胞内区的序列插入至pLVX慢病毒包装载体中，再包装至慢病毒中获得。在一个实施方式中，人源胞外区的序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术的第二个方面，提供了：由上述方法构建得到的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞。本专利技术的第三个方面，提供了：上述的肿瘤细胞在用于制备肿瘤疾病研究的模型中的应用。在一个实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n第1步，确定HER2人源序列以及所述HER2人源序列在小鼠细胞模型HER2基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型HER2基因的胞外区替换为所述HER2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；/n第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgRNA；/n第3步，设计并构建携带所述HER2人源序列的人源化载体；/n第4步，将Cas9-sgRNA载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型HER2基因敲除，获得HER2基因敲除的细胞；/n第5步，构建含有人源化HER2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的HER2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源HER2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源HER2基因的胞外区序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，确定HER2人源序列以及所述HER2人源序列在小鼠细胞模型HER2基因中的替换区域；所述小鼠细胞模型HER2基因的胞外区替换为所述HER2人源序列，而胞内区保留小鼠细胞模型的原有序列；
第2步，在人源化替换区域设计并验证针对小鼠细胞模型序列的sgRNA；
第3步，设计并构建携带所述HER2人源序列的人源化载体；
第4步，将Cas9-sgRNA载体导入小鼠细胞中，对小鼠细胞模型HER2基因敲除，获得HER2基因敲除的细胞；
第5步，构建含有人源化HER2基因的载体，通过病毒包装过程将人源化的HER2基因包装到慢病毒中，经侵染敲除鼠源HER2的细胞，使小鼠细胞模型表达含有人源HER2基因的胞外区序列。


2.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，HER2人源序列如SEQIDNO.8所示。


3.根据权利要求1所述的HER2基因人源化小鼠肿瘤细胞的构建方法，其特征在于，在一个实施方式中，针对小鼠细胞模型序列的sgRNA的序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵恩峰，贺小宏，王延宾，任江涛，韩露，
申请(专利权)人：江苏浦珠生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32