重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法技术方案

本发明专利技术公开了重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法，涉及基因工程技术领域。其包括编码大熊猫LHβ亚基的第一基因和编码大熊猫LHα亚基的第二基因，第一基因的序列为SEQ ID NO.1所示，第二基因的序列为SEQ ID NO.3所示。通过构建重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统可以实现大熊猫LHβ亚基、LHα亚基及其亚基复合物的稳定持续活性表达。表达产物可以用于诱导大熊猫发情及排卵，使用大熊猫源的促黄体生成素不会诱使机体产生不良反应，有利于大熊猫繁育质量的提升。此外，该重组制备方法简便易行，具有广泛的应用前景。

Vector, expression system and preparation method of recombinant giant panda luteinizing hormone

【技术实现步骤摘要】
重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法
本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法。
技术介绍
大熊猫是我国珍稀濒危动物，繁殖率低下制约着大熊猫种群数量与保育质量。研究表明，大熊猫繁殖率低下可能与促卵泡生成素(Folliclestimulatinghormone，FSH)、促黄体生成素(Luteinizinghormone，LH)等促性腺激素分泌不足有关。为了提高大熊猫保育质量，多年来我国使用异种外源促性腺激素(例如：马源促卵泡生成素(FSH)，马源促黄体生成素(LH))诱导大熊猫发情及排卵，然而，重复使用异种外源激素可能会诱使机体产生不良反应，进而影响其长期效果。目前，尚未有合适的方法解决上述问题。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供重组表达大熊猫促黄体生成素的载体、表达系统及制备方法以解决上述技术问题。本专利技术是这样实现的：一种重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其包括编码大熊猫LHβ亚基的第一基因和编码大熊猫LHα亚基的第二基因，第一基因的序列为SEQIDNO.1所示，第二基因的序列为SEQIDNO.3所示。促黄体生成素(LH)是由α亚基和β亚基形成的异二聚体，其中，α亚基是由120个氨基酸残基构成，其序列参照SEQIDNO.4所示，而β亚基由约141个氨基酸残基构成，其序列参照SEQIDNO.5所示。β亚基需与α亚基协作形成复合物。LH作为胞外信号分子，依赖与其特异性受体(促黄体生成素受体，LHR)发挥生物学活性。LH相对分子量约为28kDa，LH主要功能是促进性细胞成熟，刺激性激素合成，促进和维持第二性征。LH作用于卵巢，使卵泡膜产生雌激素，在卵泡发育接近成熟的时候与FSH一起作用于颗粒细胞，促进卵泡的成熟，LH作用于卵细胞周围组织使成熟卵细胞的排出得以顺利进行，参与调控非优势卵泡的闭锁和黄体化。在睾丸中，LH主要诱导睾酮生成，促进精子成熟。动物卵巢中含有大量处于不同发育期的卵泡，但并非所有的都能排出体外，约99％都发生闭锁退化，这正是由于FSH和LH共同调控的结果，纵观卵泡发育的整个过程，FSH主要在前期发生作用，LH发挥作用主要在后期，两种激素属于协作关系。在排卵过程中FSH和LH共同激发卵泡内纤溶酶原活化剂，产生大量蛋白溶解酶，使卵泡周围松散；LH突升期，卵泡中的前列腺素制造酶增加，大量前列腺素促使新血管聚集，血液集中，卵泡液增加，卵泡周围平滑肌收缩，将松散的卵子和卵丘细胞排出卵泡。LH不足会降低大熊猫对FSH的反应性，影响卵母细胞发育能力，而添加小剂量的LH，可以补救卵母细胞的发育潜能，使其发育成正常胚胎。本专利技术通过构建重组表达大熊猫促黄体生成素的载体可以实现大熊猫LHβ亚基、LHα亚基及其亚基复合物的稳定持续活性表达。表达产物可以用于诱导大熊猫发情及排卵，使用大熊猫源的促黄体生成素不会诱使机体产生不良反应，有利于大熊猫繁育质量的提升。上述载体还包括连接序列；优选的，连接序列为T2A序列，T2A的序列为SEQIDNO.2所示。T2A的氨基酸序列参照SEQIDNO.6所示。含有重组表达大熊猫促黄体生成素的载体的宿主细胞表达系统，宿主细胞表达系统是将载体转入宿主细胞中构建而成。宿主细胞为CHO-K1细胞。CHO-K1细胞株是来自中华仓鼠卵巢细胞，现广泛用于科研用途和工业生产中，将重组表达载体转入CHO-K1细胞可以用于重组大熊猫促黄体生成素的表达。一种生产重组大熊猫促黄体生成素的方法，其包括如下步骤：培养宿主细胞表达系统。培养宿主细胞表达系统前还包括载体构建步骤和细胞表达系统的构建，其包括如下步骤：A：合成第一基因、T2A序列和第二基因；B：将插入片段第一基因、T2A序列和第二基因连接到慢病毒表达载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，构建含有第一基因、T2A序列和第二基因的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体；C：将重组表达大熊猫促黄体生成素的载体-CMV-MCS-EF1-Puro及慢病毒包装质粒共转入HEK293T细胞中，收集纯化重组慢病毒并感染CHO-K1细胞，构建含有表达重组大熊猫促黄体生成素的载体的CHO-K1细胞稳定表达系统。第一基因编码大熊猫LHβ亚基，第二基因编码大熊猫LHα亚基，第一基因和第二基因可由NCBI上查阅获得。第一基因和T2A序列和第二基因一起合成，直接整体酶切连接到pCDH载体上。T2A序列在构建多顺反子载体中具有序列短小、易操作、上下游基因表达平衡性好等优点，利用T2A序列构建的LHβ和LHα共表达载体在转入CHO-K1细胞后能正常翻译。此外，T2A能够在CHO-K1细胞中发挥自裂解功能。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述步骤B中质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro先进行EcoRI和BamHI酶双酶切以线性化载体，再进行EcoRI和BamHI酶双酶切以线性化插入片段，通过T4DNAligase酶将线性化的插入片段连接到线性化的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro上。专利技术人创造性的发现，若重组表达载体中含有人巨细胞病毒早期转录增强子(humancytomegalovirusimmediateearlyenhancer)元件，则构建的重组载体转入细胞后无法得到具有活性的大熊猫重组LH蛋白，因此，选用了不包含人巨细胞病毒早期转录增强子元件的pCDH质粒作为重组蛋白表达所用载体。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述重组表达大熊猫促黄体生成素的载体通过慢病毒表达体系制备重组慢病毒感染CHO-K1细胞以获得稳定表达细胞系统；在本专利技术应用较佳的实施例中，上述慢病毒表达体系为pCDH+psPAX2+pMD2.G。慢病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：(1)表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选；(2)安全性高：未发现致病性，已被用于CAR-T治疗作用于人体；(3)免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。本专利技术提供的表达系统可以将大熊猫源LH分泌到DMEM低糖培养基中，且具有活性。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述步骤(4)是在含有嘌呤霉素的培养体系下进行细胞培养。嘌呤霉素用于筛选阳性细胞。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述嘌呤霉素的浓度为5-10μg/ml之间。在本专利技术应用较佳的实施例中，上述步骤(4)的培养方式包括如下步骤：(1)培养的CHO-K1细胞每3天传代一次，待细胞密度达到80％左右，用一次性吸管吸出DMEM低糖培养基，缓缓加入PBS没过细胞，轻轻摇晃洗涤90-mm培养皿；(2)尽可能多的吸除培养基，然后加入适量胰酶/EDTA消化液(0.25％)，用量以没过细胞为宜；(3)轻轻摇晃，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，37℃温育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其特征在于，其包括编码大熊猫LHβ亚基的第一基因和编码大熊猫LHα亚基的第二基因，所述第一基因的序列为SEQ ID NO.1所示，所述第二基因的序列为SEQ ID NO.3所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其特征在于，其包括编码大熊猫LHβ亚基的第一基因和编码大熊猫LHα亚基的第二基因，所述第一基因的序列为SEQIDNO.1所示，所述第二基因的序列为SEQIDNO.3所示。


2.根据权利要求1所述的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体，其特征在于，所述载体还包括连接序列；
优选的，所述连接序列为T2A序列，所述T2A的序列为SEQIDNO.2所示。


3.含有权利要求1或2所述的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体的宿主细胞表达系统。


4.根据权利要求3所述的宿主细胞表达系统，其特征在于，所述宿主细胞表达系统是将所述载体转入宿主细胞中构建而成；
优选的，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。


5.一种生产重组大熊猫促黄体生成素的方法，其特征在于，其包括如下步骤：培养权利要求3或4所述的宿主细胞表达系统。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养宿主细胞表达系统前还包括载体构建步骤和细胞表达系统的构建，其包括如下步骤：
A：合成第一基因、T2A序列和第二基因；
B：将插入片段第一基因、T2A序列和第二基因一起连接到慢病毒表达载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，构建含有所述第一基因、T2A序列和第二基因的重组表达大熊猫促黄体生成素的载体；
C：将所述重组表达大熊猫促黄体生成素的载体-CMV-MCS-EF1-Puro及慢病毒包装...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄炎，王亚军，张志忠，张剑南，屈元元，凌珊珊，李娟，
申请(专利权)人：中国大熊猫保护研究中心，
类型：发明
国别省市：四川;51