本发明专利技术公开了一种正常及处于不同骨质疏松病理进程的人血清差异代谢物的测定方法及应用。首先收集绝经前正常及绝经后正常、骨量减少和骨质疏松患者的血清，通过气相质谱分析技术，获得血清内代谢化合物的原始数据，采用SIMCAP-11软件建立多维统计模型寻找鉴定绝经前骨量正常及绝经后骨量正常、骨量开始丢失患者、骨质疏松患者血清中差异代谢化合物，并采用关联分析及ROC曲线分析进一步确定与骨质疏松病理进程相关性较高的几个差异代谢物，可为骨质疏松早期诊断及预防提供技术支持，对处于骨质疏松早期、大多生理生化指标尚不明确阶段的患者予以警示。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及绝经前后妇女骨质疏松血清中代谢标记物的测定方法及应用。具体涉 及采用气相色谱联用技术测定人血清中的代谢小分子物质，分析绝经前正常组（I组）及骨 量减少组（II组）、骨质疏松患者组（III组）和绝经后正常（IV组）血清之间的差异代谢 物谱，寻找与骨质疏松病理进程相关的差异代谢化合物，为骨质疏松早期及诊断提供技术 支持。
技术介绍
骨质疏松是一种以骨量减少，骨组织微结构发生破坏，骨脆性增加，骨折发生率增 加的代谢性骨病变。绝经后骨质疏松症是绝经后妇女的高发病症，为多因素性疾病：雌激素 的缺乏、遗传因素、营养状况、生活习惯、体格锻炼、月经周期紊乱、绝经早于40岁等均与发 病有关，但绝经后雌激素缺乏则是绝经后骨质疏松症发生的重要原因。在绝经后的妇女，第 一个5~7年中骨的丢失以每年1 %~5%的速度递增。 目前，通过双能X线吸收技术对骨密度进行测定是骨质疏松早期发现和诊断的黄 金标准，此外还可通过对骨代谢生化指标，如BAP，0C，Tracp5b，PINP，NTX，CTX等进行测定 来反映骨代谢情况。骨密度检测可以在正常、较低以及骨质疏松情况下推测骨密度，并预测 某些骨折发生的风险。然而骨质疏松发生过程中是非常缓慢的，短时间内变化不明显，需要 长时间的观察和连续的检测，并且一旦发现骨质流失，骨密度降低则难以逆转，给临床病人 的早期诊断带来极大的困难。 代谢组学作为一门新兴热门的组学技术已在全球范围内引起了广泛的关注。目 前，代谢组学在疾病的生物标志物的筛选、早期的诊断等方面已经发挥了重要的作用。通过 对机体内源性小分子物质的检测，代谢组学可以直观反映不同病理状态下的代谢物变化， 为骨质疏松早期诊断及预防提供一种有力的技术支持，可为骨质疏松早期患者予以警示， 一旦出现骨质疏松倾向，便可结合具体的骨质疏松诊断技术进行骨密度测定，以达到预防 的作用。GC-MS技术灵敏度高，可同时检测几百个化学性质不同的化合物，包括有机酸，氨基 酸，糖，糖醇，芳胺和部分脂肪酸等小分子代谢物。 本专利技术采用GC-MS技术对正常和处于不同病理阶段的骨质疏松患者血清进行检 测，实验设计中考虑到雌激素对骨质疏松病理进程的影响，旨在发现与骨质疏松发展进程 关联度高的血清差异代谢物，为骨质疏松早期及诊断提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是，通过GC-MS检测技术对血清生物样本进行检测， 采集图谱，将样本代谢物信息转化为可视多维矩阵，并通过对数据建模，鉴定不同病理组血 清中差异化合物，而后对鉴定出的差异内源性代谢物与骨密度进行关联性分析，并进行R0C 曲线分析，从而全面的反应随着骨量的逐渐减少血清中的代谢物变化情况。 本专利技术公开了一种骨质疏松血清代谢物的测定方法，采集不同病理组的血浆，离 心得到血清样本，加入3倍体积的含内标甲醇（内标：d27肉豆蔻，10 μ g/mL)提取，旋转蒸 发仪挥干后进行肟化和硅烷化处理，进GC-MC检测。再对数据的采集和处理，对不同病理组 血清中内源性小分子代谢物质进行PCA和PLS-DA计算，寻找不同病理组间的差异化合物。 具体步骤如下： (1)收集血清样本，样本数量不少于382 ; (2)将提供血清样本的病人按照骨质疏松进程分为绝经前正常组（I组）及骨量减 少组（II组）、骨质疏松患者组（III组）和绝经后正常（IV组）； (3)采用GC-MS联用技术对血清样本进行分析； (4)应用SnCAP-ll软件建立多维统计模型，寻找实验组别间的代谢差异化合物 谱，所述代谢差异化合物为骨质疏松病理进程中血清代谢标记物； (5)采用关联分析及R0C曲线分析进一步确定与骨质疏松病理进程相关性较高的 差异代谢物。 本方法步骤（2)中根据骨质疏松的病理进程分组，分组考虑到激素的缺失与否以 及骨量缺失程度。 本方法步骤（3)中GC-MS分析条件如下： 色谱条件：色谱柱为石英毛细管柱Agilent 19091S-433,325 °C， 30m*250 μηι*0. 25 μπι，进样量1 μ 1，采用不分流进样模式，载气为氦气，流速为lml/min，程 序升温模式：70°C保持2min，以10°C /min线性升温至300°C，300°C保持7min ; 质谱条件：进样口温度为250°C，传输管温度250°C，离子源温度为150°C，采用全 扫描模式，离子扫描范围为50~550,扫描速度是2. 91spectra/s，有300s的溶剂延迟，检 测电压是-1650V ; 本方法步骤（4)采用smcAP-ii软件对数据进行建模处理，寻找潜在差异代谢物， 步骤（5)采用关联分析及R0C曲线分析进一步确证所发现的血清代谢标记物与骨质疏松病 理进程的相关性及预测的准确性。 本方法步骤（5)中所述的骨质疏松血清差异代谢物有脂肪酸类化合物，包括油 酸、亚油酸、花生四烯酸、cis-11，14-二十碳二烯酸等，色氨酸和肌醇。 本专利技术的有益效果是： 本方法测定与骨质疏松病理进程有关的血清差异代谢物来体现患者骨质疏松程 度，并考虑到激素对骨质疏松病理进程的影响，测定方法简单，灵敏度高，对病人伤害小，可 为临床骨质疏松早期诊断及预防提供帮助和依据，对处于骨质疏松早期、大多生理生化指 标尚不明确阶段的患者予以警示。【附图说明】 图1为全扫描模式下样本的总离子流图（横坐标一保留时间，纵坐标一峰强）。 图2为四组样本的PLS-DA得分图；A :绝经前骨量正常组与绝经后骨量减少组， R2X = 0. 235, R2Y = 0. 638, Q2= 0. 337 ;B :绝经前骨量正常组与绝经后骨质疏松组，R2X = 0. 298, R2Y = 0. 664, Q2= 0. 462 ;C :绝经前骨量正常组与绝经后骨量正常组，R 2X = 0. 254， R2Y = 0. 618, Q2= 0. 375。黑色方块：绝经前正常组；黑色三角：绝经后骨量减少组；黑色星 形：绝经后骨质疏松患者；圆圈：绝经后骨量正常组。 图3为血清中差异代谢物的ROC曲线分析图；A :绝经前骨量正常组与绝经后骨量 减少组；B :绝经前骨量正常组与绝经后骨质疏松组；C :绝经前骨量正常组与绝经后骨量正 常组。【具体实施方式】 通过实施例对本专利技术进行详细描述。 (1)收集样品 参照世界卫生组织（WHO)推荐的诊断标准，骨密度值降低1~2. 5个标准差为骨 量减少组，降低等于及大于2. 5个标准差为骨质疏松组。基于以上标准，收集50~70岁年 龄段绝经前骨量正常及绝经后骨量正常、骨量减少和骨质疏松四个实验组血样。样本收集 过程中，排除标准如下： a):已知影响钙或骨代谢疾病患者，如严重吸收不良综合征、炎症性肠炎、慢性肝 病、酒精性肝硬化、未得到有效控制的原发性甲状旁腺功能亢进者或甲状腺疾病、Paget' s 骨病、骨软化病等 b):继发性骨质疏松症、类风湿性关节炎、痛风、多发性骨髓瘤等； c):严重心、肝（AST〉正常上限的2倍）、肾疾病（血清肌酐浓度>177 μmol/L) d):糖尿病患者（HbAlc>7. 7% ) e) : 1年内应用糖皮质激素（包括全身、外用、关节内、吸入），雄激素，二膦酸盐，降 钙素，含钙或铝的抗酸剂，氟化物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种骨质疏松血清代谢标记物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)采集血清样本，样本数量不少于382； (2)提供血清样本的病人按照骨质疏松进程分为绝经前正常组（I组）及骨量减少组（II组）、骨质疏松患者组（III组）和绝经后正常组（IV组）； (3)采用GC‑MS联用技术对血清样本进行分析； (4)应用SIMCAP‑11软件建立多维统计模型，寻找实验组别间的代谢差异化合物谱，所述代谢差异化合物为处于不同骨质疏松病理进程的血清代谢物； (5) 采用关联分析及ROC曲线分析进一步确定与骨质疏松病理进程相关性较高的差异代谢物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张琪，祁欢欢，马博，李静，朱建伟，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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